REPLICACION DEL DNA...
MONSERRAT539Resumen11 de Octubre de 2016
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REPLICACION DEL DNA
Una hebra de DNA puede actuar como molde para dirigir la sintesis de una habrá complementaria.
EL DNA dúplex se replica semiconservadoramente en las horquillas de replicación.
HORQUILLAS DE REPLICACION
La replicación del DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidos con el nombre de DNA polimerasas, dirigidas por DNA o simplemente como DNA polimerasas. Estos enzimas utilizan DNA monohebra como molde sobre el que catalizan la síntesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinucleosdos trifosfato adecuados. Los nuevos nucleótidos se seleccionan por la capacidad para aparearse, según la complementariedad demostrada.
Casi todas las DNA polimerasa conocidas pueden añadir únicamente el nucleótido apartado por un nucleído trifosfato. Las DNA polimerasas se describen en secciones posteriores 31-2A, 2B Y 4B.
La existencia de ojos o burbujas de replicación, estas estructuras, denominas estructuras 0 indican que el DNA dúplex se replica por una progresiva separación de las dos horas paternas, acompañando de una síntesis de sus hebras complementarias dando lugar de forma semiconservadora, a dos dobles hebras hijas.
El mecanismo de replicación del DNA basado en estructuras 0 se le denomina replicación 0.
El punto de separación d las dos hebras en el ojo de replicación, donde la síntesis tiene lugar, se denominan horquilla de replicación. Una burbuja de replicación puede contener una o dos horquillas de replicación.
REPLICACION SEMIDISCONTINUA
Las dos hebras antiparalelas del DNA dúplex se replicaban simultáneamente a medida que avanza la horquilla de replicación. Pero todas las DNA polimerasas conocidas tan solo pueden extender las hebras en la dirección 5’—3’. La DNA polimerasa es capaz de copiar la hebra paterna, mas allá de la horquilla replicación.
La mayor parte de la radiactividad y, por ello el nuevo DNA sintetizado, tiene coeficiente de sedimentación en medio alcalino. Estos nuevos fragmentos sintetizados, llamados fragmentos de Okazaki, son tan solo fragmentos de 1000 a 2000 nucleótidos, sin embargo.
CEBADORES DE RNA
Uno de los requerimientos casi universales para todas las DNA polimerasas es el extender la hebra de DNA a partir de un extremo libre. Como consecuencia de este hecho, resaltando por el establecimiento del modelo semidiscontinuo, ¿Cómo se inicia la síntesis de DNA? Los fragmentos de okazaki se puede observar que sus extremos 5’ consisten en segmentos de RNA de 1 a 60 nucleótidos, que son complementarios a la hebra de DNA molde. La RNA polimerasa, el enzima que media la transcripción y otro de menor tamaño, la primasa, que es el producto monomerico del gen denominado dnaG.
ENZIMAS DE REPLICACION
La replicación del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas. Los principales actores que participan en el proceso de replicación, son
DNA GIRASA, PROTEINA QUE SEPARAN LAS HEBRAS DEL DNA EN LA HORQUILLLA DE REPLICACION, PROTEINAS QUE IMPIDEN LA NUEVA UNION DE LAS HEBRAS ANTES DE SU REPLICACION, ENZIMAS QUE SINTETIZAN LOS DEBADOREES DE RNA, UNA DNA POLIMERASA, UN ENZIMA QUE ELIMINA LOS CEBADORES DE RNA Y UN ENZIMA QUE UNE COVALENTEMENTE LOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI CONTIGUOS
DNA POLIMERASA
Gracias a su capacidad de incorporar marcaje radiactivo en el DNA a partir de timidina trifosfato. Se le denomina DNA polimerasa 1 o POL 1 es un único polipeptido de 928 restos. Esta coloca desoxirribonucleico trifosfato de DNA. La reacción produce por el ataque de un nucelofilico, de la hebra de DNA que está creciendo sobre el a-FOFORILO del nucleído trifosfato.
La especialidad de la POL 1 por la base entrante más que un mero reconocimiento, se cree debida a la necesidad de que la nueva base forme un par de bases cuatro pares de bases A.T T.A G.C C.G poseen todos formas casi idénticas. Ellos explican que la POL 1 pueda intercambiar la timina solo con el 5- BROMOURACILO y la guanina solo con la hipoxantina. La Pol1 es posesiva porque cataliza una serie de pasos sucesivos de polimerización, normalmente unos 20 o más sin liberar el molde.
La actividad
LA ACTIVIDAD POLIMERASA Y LAS DOS ACTIVIDADES EXONUCLEASA DE LA POL 1 TIENEN LUGAR EN SITIOS DISTINTOS.
La actividad exonuleasa 5’—3’ de la POL 1 es independiente de las otras dos exonuleasa 3’---5’ y polimerasa. La estructura de rayos x del complejo formado por el fragmento Klenow y el dTMP, determinada por Thomas Steitz, indica que esta proteína está formada por dos dominios, el dominio pequeño fija dTMP cuyo fosfato 5’ interacciona con dos iones metálicos divalentes. El sitio de fijación de Dtmp forma parte de la exonucleasa 3’—5’ ello se demostró por la ausencia de esta actividad, y no de la actividad polimerasa, es un fragmento Klenow mutante, mutante, modificado por la ingeniería genética, que carecía de los sitios quelantes de iones pero que, por lo demás, poseía una estructura normal.
El dominio grande posee una hendidura prominente, el sitio activo de la polimerasa la construcción de modelos indica que este tiene el tamaño y la forma apropiados para unir una molécula de B-DNA.
LA FUNCION FISIOLOGICA DE LA POL 1 ES LA REPARACION DEL DNA
El DNA alterado, tal como se es detectada por diferentes sistemas de reparación del DNA la mayoría de ellos cortan, mediante endonucleasas, el DNA dañado en el lado 5’ de la lesión, activándose la exonucleasa de la POL1. Mientras por un lado se elimina el DNA dañado por el otro, la misma POL 1 va rellenando el hueco que resulta una de las hebras, mediante la actividad polimerasa, Así la actividad exonucleasa se incrementa diez veces cuando la función polimerasa esta activada. Es posible que la simultaneidad de las dos actividades de la POL1, escisión y polimerización.
DNA POLIERASA III
El descubrimiento de mutantes de E. coli, capaces de crecer normalmente, con una escasa actividad POL I estimulo la búsqueda de otras actividades polimerizantes del DNA. Este esfuerzo se vio recompensado cuando se encontraron dos enzimas mas, designados según el orden de su descubrimiento, DNA polimerasa II y DNA polimerasa III no se habían detectado con anterioridad debido a que sus actividades conjuntas en las condiciones utilizadas son normalmente 5%de ka actividad POL I.
Los mutantes que carecen de actividad POL II no presentan ningún defecto de mutación aparente. Se desconoce por tanto, la función fisiológica de la POL II si la tiene.
LA POL III es la DNA replicase de E. coli
La interrupción de la replicación del DNA en mutantes de Pol C sensibles a la temperatura, por encima de la temperatura restrictiva (alta) demuestra que la POL III es la DNA replicase de E.coli. Esta enzima tiene una composición de subunidades. Las propiedades catalíticas de la POL III se asemejan a las de la POL I excepto por la imposibilidad de la primera de replicar DNA monohebra unido a un cebador o DNA dúplex cortado en una de sus hebras. De esta manera la POL III actúa in vitro sobre huecos de nucleótidos en una sola hebra, situación que recuerda el estado del DNA dentro de la horquilla de replicación.
HELICASAS, PROTEINAS DE UNION Y DNA LIGASAS
La heloenzima de la POL III a diferencia de la POL I no puede desenrollar el DNA dúplex, así pues es necesario el trabajo coordinado de tres proteínas, la proteína Rep., la delicada II y la proteína de unión DNA monohebra (SSB) para desenrollar el DNA antes del avance de la horquilla de replicación en un proceso que es impulsado por la hidrolisis de ATP. La proteína Rep., producto del gen red de E.coli, separa las hebras del DNA dúplex avanzando a lo largo de la hebra conductora del DNA molde en dirección 3’---5’ y consumiendo al mismo tiempo dos ATPs por cada par de bases separado.
De modo parecido la helicasa II se desplaza a lo largo de la hebra retrasada del DNA molde en la dirección 3’-----5’.
La unión de la proteína SSB imide hibridar de nuevo a las hebras de DNA una vez separadas detrás del paso de la helicasa. Un gran número de copias de esta proteína tetrametica recubren cooperativamente el DNA monohebra, manteniéndolo así desapareado. El DNA debe ser despojado de proteínas SSB antes de que pueda ser replicado por el holoenzima de la POL III.
LA DNA LIGASA CIERRA LOS CORTES PRODUCIDOS EN UNA DE LAS HEBRAS DEL DNA
La POL I, sustituye los cebadores de RNA de los fragmentos de Okazaki por DNA, mediante la traslación de muesca. Los cortes resultantes en una de las hebras entre dos fragmentos de Okazaki adyacentes, así como en el DNA circular después de la síntesis de la hebra conductora son cerrados en una reacción catalizada por la DNA ligasa. La energía libre requerida para esta reacción es obtenida, dependiendo de la especie, a través de la hidrolisis acoplada de o bien NAD a NMN+ AMP o bien ATP a PP+ AMP. El enzima de E. COLI un monómero de 77 KD que se utiliza NAD cataliza la reacción en tres etapas.
Se cataliza la reacción e tres etapas:
- El grupo adenilo de NAD es transferido al grupo amino de un resto de LYS del enzima formado un aducto fofoamida poco común que es, sin embargo fácilmente aislado.
- El grupo adenilo de la enzima activado es transferido al extremo 5’-fosforilo de la muesca, formándose DNA adenilado. Este caso, el AMP se encuentra ligado al nucleótido en 5’ a través de un enlace pirofosfato, en lugar del habitual enlace fodiester.
- La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiester, por ataque del grupo 3’-OH sobre el grupo 5’-fosforilo, cerrado así la muesca y liberando AMP.
Las DNA ligasas que requieren ATP como las eucariotas y la del fago T4, producen PP en la primera etapa la reacción, en lugar de NMN la ligasa de T4 tiene, además la peculiaridad de que a elevadas concentraciones de DNA, es capaz d enlazar dos DNAs dúplex (ligación de extremos romos)
MECANISMOS DE REPLICACION PROCARIOTA
Los bacteriófagos se encuentran entre más formas de vida más simples y los mecanismos de replicación de su DNA reflejan claramente este hecho. Gran parte de los conocimientos sobre el mecanismo de replicación del DNA procede del estudio de este proceso en diferentes del DNA en los califagos, y después consideramos la replicación del DNA en la misma E. coli la replicación del DNA eucarioto se tratara.
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