Replicación del DNA

ESTRUCTURA DEL DNA

Esqueleto covalente de fosfatos y pentosas unidos por enlaces fosfodiéster 5’->3’. Las bases nitrogenadas se disponen de forma perpendicular al esqueleto. El porcentaje de A, G, C y T se mantiene constante. La información genética se encuentra en la secuencia de bases nitrogenadas. Consiste en dos cadenas polinucleotídicas helicoidales dextrógiras con enrollamiento de tipo plectónico: no se pueden separar las hebras sin desenrollarlas. La disposición de bases es antiparalela, las cadenas corren en direcciones opuestas, una 5’->3’ y otras 3’->5’. Las bases nitrogenadas se apilan en el interior de la hélice, con sus estructuras en anillo, hidrofóbicas y planas, y se establecen enlaces de hidrógeno entre bases complementarias: dos entre timina y adenina, tres entre guanina y citosina. La estructura será más estable cuanto mayor sea el porcentaje de C-G. Se forma un surco mayor y otro menor, diámetro 2nm, avance por base 0.34nm, avance por vuelta 3.6nm (10.5 pares de bases por vuelta). La doble hélice se mantiene unida por fuerzas hidrofóbicas que hacen que las bases se sitúen en el interior protegidas, y por enlaces de Van der Waals que se encuentran en el núcleo apolar de los que deriva la disposición de las bases nitrogenadas, además de los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias.

ESTRUCTURA DE LA DOBLE HÉLICE DE DNA

• Forma A. Aparece en ausencia de agua, no aparece en condiciones fisiológicas. Se obtiene por deshidratación del DNA-B. Es dextrógira con 11 pares de bases por vuelta, avanza 0.26nm por base y 2.86nm por vuelta. Es más ancha y compacta y las bases nitrogenadas se disponen en planos inclinados respecto al eje de la doble hélice. Es la forma del RNA en doble hélice.
• Forma Z. Se forma a partir del DNA-B durante la transcripción génica y cuando hay secuencias alternas de purinas y pirimidinas (sobre todo CG). Es levógira con enrollamiento irregular lo que provoca disposición en zigzag. Es mas estrecha y alargada. Avance por base 0.37nm y 4.44nm por vuelta. 12 pares de bases por vuelta.
• Forma B. Watson y Crick. Es dextrógira con 10.5 pares de bases por vuelta. Forma más abundante de DNA.

El DNA también puede formar estructuras en lazos y horquillas. Las secuencias palindrómicas forman horquillas y cruciformes.

El RNA no forma doble hélice en mamíferos, pero sí puede formar lazos y horquillas debido a los apareamientos parciales internos. El producto de la transcripción es una hebra simple de RNA, a veces se forman bucles.

DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA

Desnaturalización: desenrollamiento de la doble hélice debido a la ruptura de los puentes de hidrógeno, no enlaces covalentes.

Fuerzas que estabilizan la doble hélice: fuerzas hidrofóbicas, interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals.

Causas de desnaturalización:

• Aumento de temperatura: superior a la fisiológica (60-80ºC). Temperatura de fusión: aquella a la cual la mitad del DNA conserva la estructura y la otra mitad ya está desnaturalizada. Directamente relacionada con la cantidad de CG. A 100ºC el DNA está totalmente desnaturalizado.
• Valores extremos de pH. Algunas bases adquieren o ceden protones, por lo que se desestabilizan todas las interacciones del interior.
• Fuerza iónica, agentes químicos.

Renaturalización: proceso por el que el DNA vuelve a su estructura nativa. Cooperativo: si los valores de pH y temperatura son normales y las hebras se mantienen unidas por un segmento de al menos 12 bases, la renaturalización es rápida.

La desnaturalización y la renaturalización se pueden medir a través del efecto hipercrómico: la absorbancia de las bases a 260nm disminuye al formar la doble hélice. Las bases nitrogenadas absorben la luz UV, cuando están en hélice se apantallan. Cuanta más luz absorban, más separadas estarán las hebras.

Hibridación: proceso de unión de dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única estructura de doble hélice. Las dos cadenas no han tenido contacto previo. La especificidad depende de las condiciones del ensayo, se necesita una temperatura adecuada. Importante en la detección especifica de secuencias de DNA.

1. Se añade un oligonucleótido de 20-30 bases marcado con un colorante fluorescente o radiactivo (sonda de DNA) a una mezcla de DNAs desnaturalizados. Los DNAs se separan por electroforesis, el gel se transfiere a nitrocelulosa.
2. La sonda se une y identifica solamente al DNA que contiene una secuencia complementaria, a la temperatura adecuada.
3. Se detecta la sonda gracias al marcaje.

MATERIAL GENÉTICO EN VIRUS

La mayoría son virus con RNA lineal o circular, de doble hebra o hebra simple. En ocasiones el mismo RNA del virus se usa como mRNA y en otras la secuencia codificante es la complementaria, y el RNA tiene que replicarse primero para generar el mensajero. El tamaño varía mucho (2000pb-2000000pb), 1000pb equivalen a 1 gen en bacterias (no eucariotas). Todo el material genético es codificante (en eucariotas solo el 2%).

MATERIAL GENÉTICO EN BACTERIAS

Un único cromosoma de DNA circular de doble hélice. Entre 1 y 12 millones de pb. Muchas bacterias poseen plásmidos, fragmentos de DNA circular de doble hélice de 2000-10000pb con genes no esenciales, que a veces confieren nuevas propiedades a la bacteria.

REPLICACIÓN DEL DNA

Proceso por el cual a partir de una molécula de DNA se sintetizan dos nuevas moléculas de DNA hijas de secuencia idéntica a la original. Se añaden nucleótidos a la hebra molde para formar una hebra complementaria.

Es semiconservativa: la molécula de DNA se separa en dos cadenas y cada una dirige la síntesis de su cadena complementaria. Requiere un molde y un cebador de la menos 10 nucleótidos (100 eucariotas, 1000 procariotas), ya que la DNA polimerasa es incapaz de poner el primer nucleótido. El cebador es RNA que determina qué parte del DNA se copia. Dirección 5’->3’

Es bidireccional y semidiscontinua.

ELEMENTOS EN LA REPLICACIÓN DEL DNA

1. DNA POLIMERASA

Enzimas responsables de la síntesis de las cadenas hijas. Su actividad polimerasa 5’->3’ elonga la cadena nucleotídica añadiendo nucleótidos por el fosfato alfa al extremo 3’-OH liberando un pirofosfato y gran cantidad de energía. La geometría del sitio de polimerización de la DNA polimerasa hace que solo pueda entrar la base que aparea correctamente. También posee actividad exonucleasa 3’->5’ quitando nucleótidos en ese sentido en el tiempo de revisión si se da cuenta de que ha cometido un error; y actividad exonucleasa 5’->3’ quitando los nucleótidos existentes a la vez que va añadiendo los nuevos (RNA cebador de los fragmentos de Okazaki o reparaciones del DNA). No es capaz de cerrar la mella entre dos DNA preexistentes. Tipos de DNA polimerasa en E. Coli: DNA polimerasa I, II, III.

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