SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Enviado por jaca22487 • 2 de Junio de 2013 • 933 Palabras (4 Páginas) • 514 Visitas
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE
EXCLUSIÓN MOLECULAR
INTRODUCCION
La cromatografía es una técnica que permite la separación de
moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está
basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de
compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la
afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos
presentes en la mezcla resultará su separación.
La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada
filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas
de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo
de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de
los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de varios tipos:
dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A),
poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se
hallan constituidos por gránulos (particulas) de un material esponjoso
hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado.
Hypothetical partial structure of sephacryl
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a
través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un
tamaño mayor que el diámetro de los poros de las particulas, sólo podran
moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que
queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su
descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las
partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida,
cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo
de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.
Mecanismo de la cromatografía de exclusión
Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las particulas de menor
masa molecular. De ahí que las particulas de mayor peso molecular salgan
primero.
Diferentes compartimentos dentro de la columna
Diagrammatic representation of Vt and V0. Note that Vt – V0 will include
the volume of the actual fibres forming the matrix of each bead.
APLICACIONES
A) Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico,
afinidad o de interacción hidrofóbica.
B) Desalado. Proteínas, polisacáridos, polipéptidos etc. Pueden ser
desalados antes de ser concentrados o liofilizados.
C) Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.
D) Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125,
FITC de las soluciones de marcaje de proteínas.
E) Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso
molecular.
F) Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
G) Purificación de macromoléculas.
H) Determinación del peso molecular de las proteínas.
OBJETIVO
Realizar la calibración de una columna de gel filtración de sephacryl S-200
y determinación del peso molecular de una proteína problema.
MATERIAL
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