Separacion cromatografica

Laboratorio de Famacognosia

1. N° de la práctica: 1

2. Unidad curricular asignatura: Unidad 1:

3. Título: Separación cromatográfica de componentes de un extracto vegetal

4. Objetivo

• Conocer y aplicar la cromatografía en papel como técnica de separación e identificación de los componentes del extracto vegetal.

5. Fundamento y método de la práctica:

Cromatografía

Un método de separación de mezclas disponible que la química orgánica es la cromatografía. La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil. Lo compuestos pueden separarse debido a la influencia de dos efectos contrapuestos:

1. Retención. - Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporto sólido.
2. Desplazamiento. - Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de una fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita en la fase estacionaria, mientras que, la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la estacionaria.

Así, se tiene que las separaciones cromatográficas dependen de la diferencia entre los coeficientes de partición de los componentes entre dos fases inmiscibles. Una, fase móvil, progresa en relación con la otra, la fase estacionaria, y transporta las sustancias que se están separando. El coeficiente de partición K de una sustancia en un sistema de dos fases está dado por:

[pic 1]

Donde:

cs = concentración de la sustancia en la fase estacionaria.

cm = concentración de la sustancia en la fase móvil.

Cuando el coeficiente de partición es mayor para una sustancia, quiere decir que, su concentración en la fase estacionaria es mayor y es más lento su avance a lo largo del sistema cromatográfico.

Clasificación

En la Tabla 1 se muestra la clasificación de los métodos cromatográficos en función de los tipos de fases móviles y estacionarias, y en las clases de equilibrios involucrados en la transferencia de los compuestos entre las fases.

Tabla 1. Clasificación de los métodos cromatográficos

Cromatografía en papel

Es la más sencilla de las técnicas, pero solo nos proporcionará resultados cualitativos. A pesar de que está casi en desuso, conviene realizarlo para seleccionar el disolvente o mezcla de disolventes para realizar una óptima separación y además por ser económico y fácil de realizar.  El método se basa en un mecanismo de reparto, y consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extreme de una tira de papel filtro, que se deja secar. Luego se introduce la tira en un recipiente que contenga el disolvente, de manera que éste ascienda por capilaridad por la tira permitiendo que los componentes de la mezcla eluyan y se separen en función de la afinidad de los componentes con las dos fases, el más afín con la fase estacionaria se quedará cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos afines y más solubles en el disolvente tendrán un desplazamiento mayor.

En cromatografía en papel se puede determinar el factor de retención (Rf) para cada componente separado de la mezcla con la siguiente expresión:

  (Ecuación 1)[pic 2]

6. Parte Experimental

6.1 Instrucciones Previas

Los estudiantes deben seguir las normas de seguridad y precauciones estándares indicadas en la primera clase para prevenir accidentes que puedan ocurrir dentro del laboratorio.

Antes de cada práctica el estudiante debe revisar la ficha de seguridad de los reactivos que va a usar, para tomar debidas precauciones.

Material de seguridad personal: Para esta práctica es indispensable el uso de mandil, gafas de seguridad, guantes de nitrilo.

6.2 Equipos materiales y reactivos

Materiales: Mortero, pistilo, capilar (o jeringuilla con agua), papel filtro (fase estacionaria), pipeta graduada de 5ml, vaso de precipitación de 250ml, vidrio reloj, pinza de disección.

Reactivos: Hojas de acelga (o espinaca), etanol (alcohol antiséptico).

6.3 Procedimiento

• Lavar una hoja de acelga (o 3 hojas de espinaca), retirar los nervios, trocear con las manos o una tijera las hojas hasta dejar pedazos muy pequeños.
• Colocar las hojas troceadas en un mortero (o taza de porcelana), con 5 ml de etanol (alcohol antiséptico).
• Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.
• Recortar un rectángulo de papel filtro^[1] 7 x 10 cm^[2] (fase estacionaria).  
• En el rectángulo de papel filtro medir desde el borde superior 2 cm y trazar una línea tenue con lápiz, también desde el borde inferior medir 1.5 cm y trazar con línea tenue. Sobre esta línea inferior realizar la siembra de la muestra.  
• Con ayuda de un capilar (jeringuilla con aguja) succionar alrededor de 0.5 mL de extracto líquido y realizar una línea de siembra de 2 cm de largo sobre la línea trazada con lápiz en la parte inferior del papel filtro.
• Dejar secar por pocos minutos. Si la línea de siembra tiene un color poco intenso, realizar la siembra nuevamente sobre la misma línea. Dejar secar.
• Colocar una pequeña cantidad de etanol (alcohol antiséptico que es la fase móvil), en el vaso transparente de vidrio o de plástico, de tal manera que el nivel de la fase móvil esté por debajo de la línea de siembra.  
• Introducir el papel con la línea de siembra dentro del vaso y tapar con un plato de porcelana pequeño.
• Dejar el aparato armado por un tiempo para que ocurra la elución de los componentes del extracto.
• Detener la cromatografía cuando el frente del eluyente esté en la marca de 2 cm antes de llegar al borde superior de la fase estacionaria.

Figura 1. Ejemplo de registro de separación cormatográfica

[pic 3]

• Cuando el frente del eluyente llegue a la marca a lápiz del borde superior^[3], suspender la cromatografía, para esto, sacar el papel filtro del vaso con la pinza de disección o con las manos.  
• Registrar los resultados de la separación cromatográfica, con una secuencia de fotografías o un video insertado en el informe (ver ejemplo en la figura 1).
• Anotar en la Tabla 2, los colores de las bandas o zonas formadas en el papel filtro con su respectiva identificación.

7. Resultados

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