Tatea de prueba de Bilirrubina.

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Introducción:

La prueba de la bilirrubina consiste en la medición de la concentración de bilirrubina que contiene la sangre. La bilirrubina es un derivado de la descomposición de los glóbulos rojos y es modificada por el hígado para que el cuerpo la pueda expulsar al exterior.

La prueba de bilirrubina es uno de los parámetros medidos para evaluar la función hepática. Se utiliza en conjunto con otras pruebas que forman parte de la “hoja hepática”. Cabe destacar que la medición de los distintos tipos de bilirrubina puede guiar asertivamente a un diagnóstico y detectar dónde está el problema causante de la alteración.

La bilirrubina es una Una cantidad alta de bilirrubina en sangre puede indicar un problema en el hígado. En los recién nacidos, el hígado puede tardar un tiempo en empezar a funcionar adecuadamente. Las cantidades altas de bilirrubina pueden hacer que la piel y los ojos adquieran una tonalidad amarillenta, lo que se llama ictericia.

El análisis de bilirrubina en sangre debe realizarse cuando el médico cree que existe:

• Síntomas como ictericia, Coluria (orina oscura) o dolor de estómago; esto podría indicar hepatitis, cirrosis u otras enfermedades del hígado
• Para averiguar si hay alguna obstrucción en las estructuras por donde circula la bilis proveniente del hígado
• Para el seguimiento de una enfermedad o un trastorno del hígado
• Para diagnosticar trastornos relacionados con la producción de glóbulos rojos. Los niveles altos de bilirrubina en la sangre podrían ser un signo de enfermedad de la vesícula biliar, o de un trastorno llamado anemia hemolítica
• Cuando un recién nacido presenta ictericia. Esta prueba se hace comúnmente a modo de precaución porque niveles altos de bilirrubina pueden causar daño cerebral.
• Monitorear el efecto de drogas que afectan la función hepática.
• Monitorear el efecto de la fototerapia en la ictericia del recién nacido
• En caso de alcoholismo.

En el presente trabajo se realizará la medición de la bilirrubina en diferentes muestras y se hará la diferenciación entre bilirrubina conjugada, no conjugada, directa e indirecta.

PRÁCTICO 1: BILIRRUBINA

Objetivo general:

Realizar la determinación de Bilirrubina Total y Bilirrubina Directa

Objetivos específicos:

• Determinar los niveles de Bilirrubina total en muestras clínicas.
• Determinar los niveles de Bilirrubina directa en muestras clínicas.
• Determinar los niveles de Bilirrubina indirecta en muestra clínicas.

Bilirrubina y aspectos fisiológicos:

La bilirrubina es un producto de deshecho del metabolismo de la hemoglobina proveniente de la lisis los eritrocitos viejos, defectuosos o dañados, de la mioglobina, los citocromos y otras proteínas como catalasas y peroxidasas. De estas moléculas, lo que en especifico es metabolizado para la producción de bilirrubina es el grupo hemo y el proceso es realizado mediante la fagocitosis de estas moléculas por las células del retículo endotelial (UNSE, 2013).

El grupo hemo es transformado en bilirrubina por dos reacciones sucesivas que tienen lugar dentro de los macrófagos y que son catalizadas por las enzimas hemooxidasa y biliverdin reductasa. La bilirrubina formada es liposoluble y se une a albúmina mediante una unión no covalente para ser liberada a la sangre. Esta bilirrubina corresponde a la bilirrubina no conjugada.

La bilirrubina no conjugada es transportada al hígado, haciendo ingreso por la vena porta a los lobulillos hepáticos. Una vez espacio sinusoidal de los sinusoides hepáticos hará ingreso al hepatocito por medio de transportadores específicos, para lo cual se desprende de la albúmina.

La bilirrubina es transportada dentro del hepatocito hasta llegar al retículo endoplásmico donde mediante una reacción mediada por la glucoronil transferasa es conjugada con ácido glucorónico, volviéndose hidrosoluble. Esta bilirrubina corresponde a la bilirrubina conjugada.

La bilirrubina es secretada por el lado apical del hepatocito hacia el canalículo biliar y es secretada en la bilis por la vesícula biliar hacia la ampolla de Vater, en el duodeno.

La bilirrubina conjugada llega así al intestino, donde es atacada por bacterias, transformándola en urobilinógeno o estercobilinógeno. Estos productos son aquellos que le dan la coloración a las heces y también pueden volver a entrar a la circulación enterohepática siendo posteriormente filtrados por los riñones y eliminados por la orina.

Aspectos fisiopatológicos:

Por algún fallo en alguno de los procesos explicados con anterioridad para la correcta formación, secreción y eliminación de la bilirrubina puede ocurrir un aumento en la bilirrubina total en sangre. Este aumento puede producirse a expensas de la bilirrubina conjugada, no conjugada o ambas. Este fenómeno se denomina Ictericia y se presenta acompañado de múltiples manifestaciones. Característicamente se acompaña de coloración amarilla de la piel, mucosas y esclerótica de los ojos, picazón y heces y orina de coloración anormal (Gallegos, Ossa, Sierralta, & Nuñez, 2014).

Los mecanismos fisiopatológicos por los cuales puede ocurrir este aumento pueden ser:

1. Pre hepáticos: Excesiva cantidad de grupo hemo que es metabolizado en bilirrubina. Por lo cual, el hígado se encuentra sobredemandado en su capacidad de conjugar bilirrubina lo que produce el aumento de la bilirrubina no conjugada en la sangre.
2. Hepáticos: Incluye tanto incapacidad genética de metabolizar o transportar dentro del hepatocito la bilirrubina, una disfunción hepática u obstrucción intrahepática.  
3. Post hepáticos: Se refieren a una obstrucción posterior al hígado. Por lo cual, el hígado es capaz de conjugar normalmente pero la bilirrubina producida no puede excretarse normalmente hacia al duodeno, en consecuencia, el contenido de la bilis se devuelve al hígado y pasa a la sangre. Por lo tanto, se produce un aumento de la bilirrubina conjugada sérica.  

Dado que los mecanismos por los cuales se producen estos distintos tipos de ictericia son distintos, y afectan de forma diferenciada las cantidades de bilirrubina conjugada y no conjugada en sangre, sus efectos en el organismo son distintos. Por esta razón, podemos considerar la Ictericia como una evidencia de un problema mayor.

Medición de Bilirrubina y descripción de la técnica

En el presente práctico se realizó la medición de Bilirrubina total y Bilirrubina directa mediante el método de Diazo ácido.

Este método se basa en la determinación colorimétrica de un compuesto coloreado formado por la reacción específica de ácido sulfanílico diazotado con la bilirrubina de una muestra de suero o plasma. El compuesto formado es la azobilirrubina, la cual puede ser medida a 530 nm.

En estas condiciones sólo la denominada bilirrubina directa reacciona formando azobilirrubina, por lo tanto, la intensidad del color formado es directamente proporcional a la cantidad de bilirrubina directa presente en la muestra.

Para efectos de la medición de bilirrubina total en una muestra es necesario incluir un acelerador a la reacción, en específico dimetilsulfóxido. Este compuesto produce que toda la bilirrubina de la muestra reaccione formando azobilirrubina, y entonces, la intensidad del color formado es directamente proporcional a la cantidad de bilirrubina total presente en la muestra.

Procedimiento de la medición de bilirrubina directa:

• La medición mediante el método descrito es realizada a 37°C, por lo cual, para asegurar la efectividad del método todas las muestras y reactivos a utilizar debieron ser preincubados en un baño termorregulado a 37°C.
• Además, dado que se ha demostrado que la luz directa sobre las muestras puede ocasionar un descenso de hasta un 50% en los valores de bilirrubina, las muestras a analizar se protegieron de la luz envolviéndose en papel alusa.
• En tubos rotulados debidamente, se colocó la muestra a determinar y el reactivo 1. Se incluyó la preparación de calibrador como muestra para el posterior cálculo del factor de calibración y un blanco. Los volúmenes de muestra y reactivo 1 utilizadas se especifican en la tabla 1.
• Cada tubo fue agitado e incubado a 37°C durante 5 minutos.
• Transcurridos los 5 minutos exactos se blanqueó con el blanco preparado en el espectofotómetro a una longitud de onda de 546nm. A la vez, se agregó el reactivo 2 en los tubos restantes. El volumen de reactivo 2 utilizado se especifica en la tabla 1.
• Cada tubo fue agitado e incubado a 37°C durante 5 minutos.
•  Transcurridos los 5 minutos exactos se midió la absorbancia de cada tubo. Los resultados se encuentran en la tabla 2.

Tabla 1: Protocolo de la determinación de Bilirrubina directa para la preparación de cada tubo ocupado en el práctico. Se especifican volúmenes descritos según el fabricante.

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