Tincion diferencial acido resistente

Tincion diferencial acido resistente

Introducción

La tinción acido resistente es una tinción diferencial que mide en células teñidas la resistencia a la decoloración mediante acido. La propiedad de ácido resistencia en ciertas micobacterias y actinomicetos esta correlacionada con su alto contenido lipídico. Teñir estas bacterias requiere un tratamiento de alta temperatura y la utilización de colorantes fuertemente afines.

El procedimiento consiste en teñir con carbolfucsina caliente, decolorar en una solución de alcohol ácido y re teñir con un contrastante. Las bacterias acido resistentes se decoloran muy lentamente son la solución alcohol acido en comparación a otros microorganismos y retienen el colorante inicial.

Este tipo de coloración es utilizada en el estudio y diagnóstico de enfermedades causadas por especies acido-resistentes como los de la tuberculosis y lepra. Y también para la diferenciación de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.

Tincion de endosporas

Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada endospora. A diferencia  de la célula vegetativa la endospora es una estructura resistente capaz de sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de alta temperatura o bajo la acción de agentes químicos.

Existen varias técnicas para la tinción de endosporas. Destacan entre ellas la de Dorner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbolfucsina para teñir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tinción negativa; la espora se tiñe de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro. La técnica de Schaeffer & Fulton emplea carbolfucsina para teñir la espora, alcohol acido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; La espora se tiñe de roo y la parte vegetativa de verde. Ambas técnicas emplean el fenol y alta temperatura como agente coadyuvantes para lograr penetración de la fucsina en la estructura de la espora.

Objetivo:

• Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.

Ejercicio N°1

Materiales:

• Cultivos de 48 horas Bacillus sp, Clostridium sp.
• Aceite de inmersión
• Asa de Kolle
• Baño de agua a 100°C
• Láminas portaobjetos
• Soluciones colorantes: Carbolfucsina y Nigrosina
• Tubos con agua destilada estéril

Procedimiento

1. Haga una suspensión concentrada del organismo en 2 o 3 gotas de agua destilada contenida en un tubo pequeño de prueba.
2. Añada igual volumen de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua hirviendo por 10 minutos
3. Transfiera una gota de la suspensión de células hervidas a una lámina porta objetos
4. Agregue una gota Nigrosina (usaremos tinta china) y extienda la mezcla con ayuda de otra lámina hasta obtener una delgada película
5. Seque la lámina al aire o dentro de papel secante (como usamos tinta china es preferible NO usar papel secante)
6. Examine al microscopio compuesto bajo un objetivo de inmersión
7. Elabore los esquemas correspondientes.

Ejercicio N°2

Materiales

• Cultivos de 48 horas Bacillus sp, Clostridium sp.
• Aceite de inmersión
• Asa de Kolle
• Láminas portaobjetos
• Mechero de alcohol
• Pinzas
• Soluciones colorantes
• Carbolfucsina
• Verde Malaquita
• Solución decolorante: alcohol ácido

Procedimiento

1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado
2. Agregue a la preparación carbolfucsina hasta cubrirla totalmente
3. Con ayuda de una pinza caliente la lámina con el colorante haciéndola pasar ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de vapores
4. Mantenga esta condición durante tres minutos, evitando que el decolorante se seque o entre en ebullición
5. Lave con alcohol ácido hasta que éste resulte incoloro
6. Enjuague con agua
7. Cubra la preparación con unas gotas de verde malaquita dejando que actúa por dos minutos
8. Enjuague con agua
9. Seque la lámina al aire o dentro de papel secante
10. Examine al microscopio compuesto bajo un objetivo de inmersión
11. Elabore los esquemas correspondientes.

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