Informe de Microbiología TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

PRÁCTICA Nº: 3

Título de la Práctica: Tinción Deferencial de Gram 

Día: Lunes

Fecha: 12/08/2019

Hora: 07:00 a 09:00  hs.

Analista:

• Diego Agustin Gamarra Vega

Objetivos:

• Aprender a realizar la tinción de Gram correctamente
• Determinar las diferencias que existen entre las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas de acuerdo a su pared celular y la coloración que adquieren estos.

Fundamento:

.

En la realización de una tinción de Gram se utilizan dos colorantes, uno de carácter primario, como es el cristal violeta, y otro de contraste, como la safranina. También se utiliza un mordiente para la safranina, como es el lugol, y un decolorante como el alcohol/acetona.

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad de la pared celular de las bacterias, la cual depende de su composición para que el microorganismo sea considerado Gram Positivo o Gram Negativo.

Los microorganismos Gram Positivos se diferencian de los Gram Negativos en que tienen más Mureína (Peptidoglicano), una pared celular con presencia de ácidos teitoicos que esta solamente anclado en el peptidoglucano y ácidos lipoteicoicos anclado a la cara interna de la pared celular. Los Gram Negativos tienen menos mureína (Peptidoglicano) en su pared celular y no tienen ácidos teitoicos ni lipoteicoicos lo que permite que ocurra la decoloración ya que su pared celular es demasiado delgada para retener el complejo de cristal violeta/yodo, a diferencia de los Gram Positivos que al poseer una pared celular más resistente la cual impide la salida del complejo cristal violeta/yodo manteniendo un color azul-violeta.

Esta técnica sirve para clasificar las bacterias como:

• Cocos Grampositivos.
• Bacilos Grampositivos.
• Cocos Gramnegativos.
• Bacilos Gramnegativos.

Materiales, muestras y equipos utilizados:

 Materiales:                                                              Reactivos:

Portaobjetos                                                           Solución de cristal violeta              

Ansa de platino                                                       Safranina    

Mechero                                                                  Solución de Lugol

Aceite de inmersión                                                        Alcohol 96 %

Piseta con agua destilada

Muestras:                                                                                Equipos:

     Cultivo liquido de Levadura                                        Microscopio

     Cultivo sólido

Metodología de trabajo:

Se delimitó la zona de extensión en el portaobjetos con el marcador indeleble y se esterilizó el ansa en la llama del mechero llevándolo hasta el rojo vivo, se dejó enfriar y se procedió a tomar la muestra liquida de levadura, primeramente flameando la boca del frasco. Se tomó la muestra y se extendió sobre portaobjetos para luego dejarlo secar al aire.

 Una vez seca la muestra se tiñó con la solución de Cristal Violeta dejándolo actuar por 1 minuto, se lavó el exceso de tinta en la bacha con agua destilada y se agregó la solución de Lugol, se dejó actuar por 30 segundos y se volvió a lavar el exceso de lugol con agua destilada, una vez lavado se decoloró la muestra con alcohol al 96 % durante 30 segundos y se volvió a lavar con agua destilada, por último se volvió a teñir la muestra con safranina y se dejó actuar por 3 minutos, luego se lavó y se dejó secar.

  Con la muestra solida se procedió a agregar una gota de agua destilada en el portaobjetos y luego a esterilizar el ansa en la llama del mechero, se dejó enfriar  el ansa en el interior de la tapa de la placa Petri y se raspó para tomar la muestra, una vez tomada la muestra se depositó en la gota de agua destilada y se extendió sobre el portaobjetos, se dejó secar para luego realizar el mismo procedimiento de tinción de Gram que se hizo para la muestra liquida de levadura y se dejó secar al aire.

  Una vez secas las muestras y con las tinciones correspondientes se realizó la observación en el microscopio.  

Características

M.O. GRAM +

Cultivo: Liquido de Levadura

Aumento Total: 400x

Forma de

microorganismo: Cocos

[pic 2]

Características

                    M.O. GRAM -

Cultivo: Sólido

Aumento Total: 1000x

Forma de

microorganismo: Bacilos

[pic 3]

Análisis de resultados:

Al realizar la observación microscópica se logró visualizar claramente en la muestra liquida de levadura microorganismos Gram Negativos agrupados en forma de cocos con una coloración violeta negruzca, también se obtuvieron observaciones de la muestra sólida bacterias con forma de bacilos de color rosa que se vieron mucho más opacos que los Gram Positivos a la hora de identificarlos

Cuestionario:

1. Explica en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram.

Las células bacterianas  se tiñen sin problemas con cristal violeta, un colorante básico y se tiñen poco o nada con colorantes ácidos, como la eosina. El cristal violeta es introducido activamente por las bacterias, por eso solo las vivas se teñirán, además las características ácidas de las células procariotas son las que permiten esta coloración básica.

El lugol forma un compuesto insoluble con el cristal violeta. El lavado con alcohol: acetona, un solvente lipídico, actúa en la pared celular y afecta a la membrana plasmática a la que se unen los péptidoglucanos de la pared en las bacterias GRAM- de tal manera que dejan salir el complejo lugol-cristal violeta.  Por otra parte las GRAM+ poseen una gruesa pared de péptidoglucanos con pocos lípidos por lo que el alcohol: acetona no puede entrar y retienen el colorante. Si la decoloración no se lleva a cabo correctamente las bacterias GRAM- pueden aparecer como positivas.

Para concluir se añade la safranina que es un tinte de contraste que tiñe en rojo, de esta manera las células GRAM- quedan teñidas en rojo-rosa de forma diferenciadora de las GRAM+ que se tiñen en violeta intenso o azul

1. ¿Por qué se utiliza un mordiente en la tinción?

La mordiente es muy útil en la técnica de Gram haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana.

1. ¿Cuál es el fin del uso de un decolorante en la tinción de Gram?

Hace que las bacterias ácido-alcohol sensibles se decoloren mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.

1. ¿Cuáles son las fuentes de errores más comunes en la tinción de Gram?

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano y teñirse como Gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias Gram positivas ej. S. aureus y Gram negativas ej. E. Coli.

1. ¿En la tinción de Gram podría omitirse un paso y aun así sería posible la diferenciación entre células Gram positivas y Gram negativas? ¿Cuál es ese paso?

Se podría omitir el paso de agregar safranina para la tinción de las bacterias Gram positivas, ya que al estar decoloradas las Gram positivas y las Gram negativas tienen el color violeta impregnado en sus paredes se podría diferenciar a los tipos de bacterias uno por su color y el otro se distinguiría de color transparente pero necesitaría más experiencia para identificarlos.

1. Explica, químicamente, lo que es la solución de Lugol.

El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada.  En microbiología se emplea en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta. El I2 entra en las células y forma con el colorante cristal violeta un complejo insoluble en agua.

Bibliografía:

• Introducción a la microbiología 9ª EDICIÓN.

Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Editorial Médica Panamericana.

• Manual de Microbiología General

María M. Reynoso. Río Cuarto: UniRío Editora, 2015. E-Book.- (Pasatextos).