Tinción Diferencial De GRAM

1. INTRODUCCIÓN

En el mundo de los microorganismos existe una gran variedad de bacterias, hongos y protozoos. Dentro de las bacterias existen diferentes clasificaciones pero la más importante es la que dio el bacteriólogo danés Christian Gram, la tinción Gram.

La tinción Gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas. Esta diferencia se basa en la anatomía de la pared celular de estos microorganismos. Además, esta tinción permite clasificar bacterias en base a su formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). En un laboratorio clínico es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos.

Las bacterias se tiñen Gram positivas, Gram negativas o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada. Por otro lado, las bacterias Gram negativas tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante, la safranina.

2. OBJETIVOS

• Identificar con la tinción Gram, bacterias Gram positivas y Gram negativas en diferentes muestras.

• Identificar el tipo de bacteria Gram en una muestra de un cultivo joven.

• Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos grupos principales de bacterias.

• Reconocer la morfología de bacterias Gram, en los diferentes tipos de muestra.

3. RESULTADOS

Muestra: Excreta de gallina con suero de leche

Muestra: Fertilizante de anchoveta

Muestra: Fertilizante de extracto de vaca.

Muestra: Yogurt Fresh (Laive)

Muestra: Bacillus Cereus

4. DISCUSIONES

• En el procedimiento de tinción Gram tienen como principal colorante al cristal violeta como colorante principal, y safranina como colorante de contraste.

• Durante la observación de la excreta de gallina mediante el microscopio se puedo observar la presencia de estreptococos y además de la presencia de bacilos .Los cuales responden a la tinción Gram positivas.

• En el caso del yogurt se pudo identificar la presencia de estreptococos, no pudimos observar la presencia de lactobacilos .recordemos q estos microorganismos tiene un crecimiento optimo entre los 40 y 45°, y se detiene su metabolismo a los 10° . el microorganismo encontrado es un estreptococos del tipo termófilo encargado fermentar glucosa, fructuosa y lactosa.

• En la muestra dada por el laboratorio pudimos observar bacilos. el cual reacciona con el cristal violeta mostrando un color violeta.

• En el caso del fertilizante de anchoveta se pudo observar fertilizante de anchoveta en proceso de gemación, como también cocos y bacilos Gram positivo.

5. CONCLUSIONES

• Las diferentes clases de bacterias reaccionan de modo diferente frente a la tinción diferencial de Gram, debido a la diferencia entre sus paredes celulares.

• Se logró identificar el tipo de bacteria según la coloración que mostraron, en el caso de color azul Gram positivas y en el caso del color rojo Gram negativas

• Se reconoció e identificó la morfología de las bacterias para los distintos grupos de muestra.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• GARCÍA MARTOS. P; FERNANDEZ. M.T; PAREDES. F. 1993. Microbiología Clínica Práctica. Editorial Universidad de Cádiz, Servicio de Publicaciones. Cádiz. España. Pag 42-43.

• RODRÍGUEZ. E; GAMBOA. M; HERNANDEZ. F; GARCÍA. J. 2006. Bacteriología General, Principios y Prácticas de Laboratorio. Primera Edición. Editorial Universidad de Costa Rica. Costa Rica. Pag 63-64.

• Willey, Joanne M. Microbiología de Prescott, Harley y Klein.2009. Madrid-España

• Tortora .Introducción a la microbiología. Novena edición. Editorial médica americana.2007. Buenos Aires- Argentina

7. CUESTIONARIO

7.1 ¿Bajo qué circunstancias la tinción diferencial de Gram podría resultar errática?

Pureza del colorante. A mayor grado de impurezas, mayor error y menor calidad de tinción.

Concentración del colorante. A mayor concentración, mayor error en la tinción; igual que a menor concentración.

El pH del colorante. Este es un factor fundamental ya que depende de las estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado. Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:

• Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.

• Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

Conservación del colorante. Se debe conservarse en lugares frescos, secos, y obscuros; envasados y etiquetados.

Técnica Empleada. Se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada técnica de tinción.

Temperatura. En la mayoría de los casos, se utiliza la temperatura ambiental pero si existen algunas técnicas que requieran de temperatura adecuada.

Cantidad de la muestra. Deberá ser representativa y homogénea pero no muy grande.

Realizar correctamente el frotis. Se debe fijarse bien para que cuando se les añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microrganismos que se desee observar.

Soluciones mordientes. En ciertos casos son necesarios ya que actúan como fijadores y ayudan a la fijación del colorante a las correspondientes estructuras.

Tiempos de Tinción. Es necesario que todas las sustancias se mantengan en la preparación un tiempo preciso y variable según la tinción.

Edad de la bacteria. La reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglucanos y teñirse como gram negativos). Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.

La edad de las células, las condiciones de cultivo y la actividad de sus autolisinas pueden afectar el resultado de la tinción. Las células envejecidas, o crecidas en condiciones que impiden la síntesis de mucopéptido pueden verse de color rojo.

Errores del operador. Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas. Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gran positivas y gran negativas. Otros factores que el técnico debe controlar:

• Impurezas en los reactivos de Tinción.

• Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.

• pH inadecuado.

• El colorante se fija a la célula por mecanismos físico-químicos, que se alteran si el pH no es el apropiado.

• Tiempo de Tinción incorrecto.

• Temperatura suficiente.

• No respetar los tiempos dados para cubrir la muestra, si el tiempo es muy corto, la célula bacteriana no se teñirá, si los tiempos son demasiado largos la célula se teñirá tanto que no será decolorara y el segundo colorante no se verá al observar en el microscopio.

• No retirar el primer colorante por no agregar alcohol acetona.

• No agregar un colorante.

• Cambiar el orden al agregar los colorantes.

Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

En el paso de decoloración se puede omitir el lavado con agua (después del cristal violeta).

En algunos casos los lavados excesivos generan errores en la coloración, por eso se puede evitar lavar con agua (no se debe omitir lavar con etanol, el decolorante).

Durante la tinción: Si la técnica dice por ejemplo; aplicar lugol durante 1 minuto, se puede dejar solo 50 segundos, ya que, en algunos casos; si lo dejas el tiempo exacto, la muestra se quema y al observar solo se verán manchas negras y/o anaranjadas.

7.2 ¿Qué efecto traería remplazar el lugol con otro agente oxidante?

Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared celular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en

...