Tp Cloroplastos IBMC

TRABAJO PRÁCTICO N° 7

CLOROPLASTOS

Introducción:

Casi todas las formas de vida en la Tierra dependen de la capacidad de algunos organismos de transformar la energía lumínica en energía química a través de una serie de procesos complejos que originan, además, materia orgánica a partir de materia inorgánica. Estos procesos reciben en su conjunto el nombre de fotosíntesis. La fotosíntesis puede ser dividida en 2 fases: Fase Lumínica o Reacción de Hill y Fase Oscura o Reacción de Calvin. La fotosíntesis ocurre en unos orgánulos llamados cloroplastos que son propios de plantas y algas (organismos fotoautótrofos) capaces de fotosintetizar. Los cloroplastos se encuentran delimitados por 2 membranas (externa e interna) y en su interior poseen unas vesículas con forma de sacos aplanados llamadas tilacoides y el estroma, que es el medio que se encuentra entre la membrana interna y los tilacoides. La fase lumínica ocurre en la membrana de los tilacoides, en la cual la luz es absorbida por un complejo formado por clorofilas, el denominado “par especial”, y proteínas que forman los llamados fotosistemas.

Los fotosistemas I y II son los encargados de captar la luz y transportar los electrones a través de una cadena de aceptores. El aceptor final es el NADP+ que en su forma reducida se presentará como NADPH + H+. El transporte de electrones por una serie de aceptores es un proceso muy complejo que puede simplificarse mediante la siguiente reacción:

NADP+ + 2e- + 2H+ → NADPH + H+

El NADPH + H+ producto de la transferencia de e-, junto al ATP producido debido a una diferencia de concentraciones de H+ entre el espacio tilacoide y el estroma, serán usados en la Fase Oscura para generar azúcares y O2. Este último producto es liberado finalmente al medio.

Objetivo:

 Verificar la capacidad fotosintética de cloroplastos extraídos de células de hojas de espinaca a través de la comprobación de la Reacción de Hill o fase luminosa en condiciones de luz artificial.

 Determinar el efecto de distintos tratamientos sobre el cloroplasto y deducir la acción de los mismos sobre la capacidad fotosintética midiendo el efecto acromático.

Metodología:

La experiencia puede dividirse en 2 etapas: la preparación y aislamiento de los cloroplastos y la verificación de la actividad fotosintética e integridad de los cloroplastos.

Preparación y aislamiento de los cloroplastos

Se parte desde aproximadamente 200 gramos de hojas de espinaca para el aislamiento y purificación de cloroplastos. A ésta cantidad de hojas, se las troza y luego se le agrega 350ml de BH10 frío, que es un buffer de homogeneización. A partir de ésta mezcla se licuó a fin de poder romper las células y aislar los componentes celulares, incluidos los cloroplastos. A través de un embudo de algodón humedecido con BH10 se filtró lo obtenido, y se centrifugó el filtrado a 5000rpm durante 10 minutos a 4°C. El BH10 contiene entre otras cosas sacarosa 10%m/v (292 mM), y se usó para darle mayor concentración de la misma al agua, evitando así la entrada de agua en el cloroplasto por diferencia de concentraciones entre el medio interno y externo, y su posterior lisis. Todos éstos pasos fueron realizados por los docentes. En el precipitado o pellet quedaron los cloroplastos, por lo tanto se descartó el sobrenadante.

El preparado del gradiente de sacarosa se realizó en un tubo de centrífuga de 50ml. Para esto se agregaron primero 8ml de una solución de BH60 (idem BH10 pero con sacarosa 60% m/v). Luego se agregaron 8ml de BH40 idem BH10 pero con sacarosa 40% m/v), y finalmente se agregaron también 8ml de BH20 (idem BH10 pero con sacarosa 20% m/v). Estas adiciones fueron realizadas con mucho cuidado debido a que se buscó mantener la diferencia de fases entre cada una de las soluciones debido a la diferencia de densidades entre cada una.

Una vez obtenido el pellet de cloroplastos se lo resuspendió en 2ml de BH10. Para poder disolver todo el pellet de manera adecuada, con la pipeta Pasteur se pipeteó de manera constante la resuspensión hasta obtener un homogenato. Este proceso fue realizado en hielo debido a que los cloroplastos son muy frágiles y mantenerlos en hielo asegura su integridad. Se agregó ésta suspensión de cloroplastos al tope del gradiente con mucho cuidado y se dejó centrifugando a 4°C durante 15 minutos. Ésta centrifugación si bien fue hecha sin parar se realizó a distintas rpm. Se centrifugó por 5 minutos a 4000 rpm y 10 minutos a 7000 rpm. Pasado éste tiempo se observó que la mayoría de cloroplastos quedaron en la interfase entre BH40 y BH60. Con una pipeta Pasteur se los retiró con mucho cuidado y se los trasvasó a un tubo de ensayo. Debido a que la suspensión obtenida no parecía ser únicamente de cloroplastos, se la homogeneizó lentamente con la pipeta Pasteur y se lo dejó en hielo.

Verificación de la actividad fotosintética e integridad de los cloroplastos

Se realizó una experiencia por duplicado para verificar la actividad fotosintética de los cloroplastos tanto en la luz blanca como es la oscuridad. A cada uno de los 6 tubos se le agregó lo que indica la siguiente tabla:

Tabla 1: Tabla de soluciones a preparar por duplicado para la verificación de actividad fotosintética de la suspensión de cloroplastos.

La verificación de la actividad fotosintética se da por medio de la reducción del DCPIP. El DCPIP oxidado es de color azul, mientras que en su estado reducido se vuelve incoloro.

Una vez agregados los cloroplastos en los tubos 1 y 3, se mezcló cada uno y se colocó una serie de los duplicados bajo luz artificial y la otra serie se colocó en la oscuridad. Se midió el tiempo que tardó en llegar al efecto acromático el tubo 3 de la serie colocada bajo luz blanca, que fue usado como tiempo de referencia. La serie de tubos colocados en la oscuridad se usó para hacer un control negativo.

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