Transfectadas condrocitos humanos

Transfectadas condrocitos humanos: la sobreexpresión de IGF-I y SOX9 mejora la síntesis de componentes de la matriz del cartílago de colágeno-II y glicosaminoglicanos

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Abstracto

Daño al cartílago causa una pérdida de colágeno de tipo II (Col-II) y glicosaminoglicanos (GAG). Para restaurar la arquitectura del cartílago original, se necesitan factores celulares que estimulan Col-II y la producción de GAG. el factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I) y factor de transcripción SOX9 son esenciales para la síntesis de la matriz del cartílago, la proliferación de condrocitos, y el mantenimiento fenotipo. Se evaluó el efecto combinado de IGF-I y la expresión del transgen SOX9 en Col-II y la producción de GAG ​​por los condrocitos articulares humanos cultivados. Transfección transitoria y cotransfección se realizaron utilizando dos plásmidos de expresión (de mamífero pCMV-SPORT6), uno para cada transgén. Al día 9 después de la transfección, los condrocitos que se sobreexpresan IGF-I / SOX9 mostraron 2 veces mayor de la expresión de ARNm del gen de Col-II, así como un aumento del 57% en proteína Col-II, mientras que el colágeno tipo I de expresión ( Col-I) se redujo en un 59,3% en comparación con los controles. La producción de GAG ​​por estas células aumentó significativamente en comparación con los controles en el día 9 (3.3- vs 1,8 veces, un aumento de casi el 83%). Por lo tanto, IGF-I / SOX9 cotransfected condrocitos pueden ser útiles para las terapias del cartílago articular basados ​​en células.

Palabras clave: colágeno tipo II; glicosaminoglicanos; transgenes IGF-I / SOX9; condrocitos humanos; Cartílago articular; La co-transfección

Introducción

El cartílago articular es un tejido avascular y altamente organizada caracterizada por una baja densidad celular, propiedades biomecánicas complejas, y una capacidad pobre para la curación. Después de la lesión, el colágeno tipo II (Col-II) y glicosaminoglicanos (GAG), dos componentes principales y esenciales de la matriz extracelular del cartílago, se pierden. El tejido de reparación que se forma no es cartílago hialino, pero en lugar de un brocartilage fi rica en colágeno de tipo I (Col-I) (1), que finalmente falla (2). Por lo tanto, se necesita un método que puede inducir la reparación adecuada de cartílago dañado. Las intervenciones quirúrgicas actuales, como la microfractura, injertos condrales, y el trasplante de condrocitos, entre otros, no son capaces de restaurar la superficie del cartílago original (3). Para restablecer la integridad estructural del cartílago hialino después de la lesión, la transferencia de genes que codifican factores que aumentan la proliferación celular y su diferenciación en condrocitos articulares se ha propuesto (4). La regeneración del cartílago articular es un proceso complejo que requiere la estimulación por varios factores condrogénicas. Por lo tanto, una estrategia terapéutica basada en la entrega de múltiples genes recombinantes pueden inducir la reparación mejor funcional (5). Debido a sus efectos condrocostales-regenerativa, genes que codifican para el factor de crecimiento broblastos fi 2 (FGF-2) (6), factor de crecimiento transformante b (TGF-b) (7), proteínas morfogenéticas de hueso 7 y 2 (BMP-7 y BMP -2) (8), factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) (9), y el factor de transcripción SOX9 (10) han sido transferidos a los condrocitos, tanto individualmente como en combinación (5,11). Los alentadores resultados han sido reportados con el uso de la combinación, en lugar de una sola, la transferencia de genes (4,12). Sin embargo, la simultánea , No se han reportado efectos de IGF-I y SOX9, dos de los principales factores que intervienen en la síntesis de la matriz por los condrocitos en el cartílago articular humano. IGF-I induce efectos fi c anabólicos específicas en explantes de cartílago y las monocapas de condrocitos. Los condrocitos transfectadas con la exposición gen IGF-I un aumento de la síntesis de grandes agregados de proteoglicano que se compone parcialmente de GAG ​​y Col-II (7,9). Además, SOX9 es un factor de transcripción capaz de cambiar el equilibrio metabólico hacia la síntesis de componentes de la matriz de cartílago hialino, así como la estimulación de la diferenciación de condrocitos (12). La mayor parte de la transfección de genes para estimular la reparación del cartílago se hace uso de virus (12,13). Estos vectores tienen la expresión a largo plazo, pero pueden producir efectos con consecuencias indeseables, tales como la inducción de la sistémica en el síndrome de respuesta inflamatoria después de la administración sistémica de vectores adenovirales y la desregulación de la proliferación de células T derivado de la actividad de retrovirus potenciador (14). cotransfección transitoria usando plásmidos como vectores ha producido resultados prometedores (15). Los plásmidos se mantienen activos dentro de las células sólo durante un breve, pero su fi ciente, la cantidad de tiempo para expresar los genes deseados, dando lugar a la posterior cicatrización del cartílago (16), mientras que la reducción de los riesgos potenciales para los pacientes. En el presente estudio, se realizó una cotransfección transitoria de los condrocitos con plásmidos que llevan el ADNc para tocreatecotransfectedchondrocytes SOX9 IGF-I y (CTC). Nos cuantificados de la expresión de IGF-I y SOX9 y evaluado el efecto de estos dos factores en Col-II y GAG synthesisintheCTC comparación withthoseof condrocitos no transfectadas (NTC) y condrocitos transfectadas con sólo el oneplasmidcodingfor IGF-I (IGF-I-TC) o SOX9 (SOX9-TC). También determinamos los efectos de IGF-I, SOX9, o ambos factores en la síntesis de Col-I, que es un componente principal de la matriz ósea, pero no de cartílago hialino (17).

Material y métodos

IGF-I y el plásmido SOX9 vectores

Un plásmido pCMV-SPORT6 columna vertebral (Open Biosystems Inc., EE.UU.) se utilizó para construir los plásmidos SOX9 pCMVSPORT6 IGF-I y pCMV-SPORT6. IGF-I de ADNc se clonó en el plásmido pCMVSPORT6 de mamífero usando las enzimas de restricción NotI y SalI (Invitrogen, EE.UU.). El mismo proceso de construcción se siguió para crear un plásmido pCMV-EGFP SPORT6 que lleva el ADNc para la proteína fluorescente mejorada fl verde (EGFP). La secuencia EGFP se obtuvo a partir del plásmido pIRES2-EGFP (amablemente proporcionado por el Dr. Martín Canizales, MD, Anderson Cancer Center, Houston, TX, EE.UU.). El vector pCMV-SPORT6 contenía el gen resistente a la ampicilina seleccionable y un origen de pUC, lo que permitió el plásmido ampli fi cación en Escherichia coli TOP 10. El pCMV-SPORT6 SOX9, pCMV-SPORT6 IGF-I, y los plásmidos pCMV-SPORT6 EGFP fueron purifica a través de una columna de membrana de sílica con un kit de plásmido Midi (Qiagen, EE.UU.).

aislamiento de condrocitos humanos y la cultura

condrocitos humanos se obtuvieron a partir de los restos no utilizados de tres biopsias de cartílago. Las células se recuperaron utilizando sucesivos digestiones de cartílago con 0,25% de tripsina y 2 mg de colagenasa tipo II / ml (Sigma-Aldrich Co., EE.UU.). Los condrocitos se suspendieron en medio Opti-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, gentamicina (0,05 mg / ml) y anfotericina B (50 ng / ml; medio completo), todos comprados a Gibcos (Thermo Fisher Scientific c, EE.UU.). Cuando las monocapas alcanzaron 80% confluencia, se recogieron los condrocitos, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (Sigma-Aldrich Co.), y su concentración se ajustó a 2? 105 células / ml en medio completo. Las alícuotas de la suspensión de células se sembraron en pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (Corning Incorporated, EE.UU.) que contienen 1 ml de medio completo y se incubaron a 37 ° C durante 24 h en una atmósfera de CO2 al 5%.

transfección de condrocitos

Las monocapas de condrocitos en 80% confluencia se transfectaron con una mezcla del plásmido pCMV-SPORT6 EGFP y el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Applied Bioscience, EE.UU.), utilizando 1: 3, 2: 3, y 1: 6 proporciones de plásmido mg a FuGENE ml y se incubó a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 48 h. Se determinó el número de condrocitos fluorescentes fl usando un microscopio Nikon 50i con un epi fluorescencia iluminador (Nikon Instruments Inc., EE.UU.) a una Magni fi cación de 20 ?. La deficiencia de transfección ef se registra como el porcentaje de células fluorescentes fl calculados con respecto al número total de células observadas en ocho campos microscópicos seleccionados al azar. Este experimento se realizó por triplicado. transfección con pCMV-condrocitos SPORT6 SOX9 y pCMV-SPORT6 IGF-I se realizó utilizando 1,0 mg de ADN plásmido y 3,0 ml de reactivo Fugene 6. La cotransfección con ambos plásmidos se realizó con 2,0 mg de ADN plásmido (1,0 mg pCMV-SPORT6 SOX9 y 1,0 mg pCMV-SPORT6 IGF-I) y 6,0 ml de reactivo de transfección FuGENE6 por pocillo. Estas preparaciones se incubaron durante 3, 6, o 9 días a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Todas las transfecciones de condrocitos se realizaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante reactivo de transfección FuGENE 6.

La estimulación de la proliferación por parte de IGF-I y SOX9

Se contó el número de NTC, el IGF-I-TC, TC-SOX9, y CTC con un microscopio Nikon (Nikon Instruments) a una Magni fi cación de los 40? en ocho campos seleccionados al azar por cada pocillo de la microplaca.

La extracción total de ARN y RT-PCR 

en el día 3, 6, y 9 después de la transfección (PT), el ARN total fue aislado de transfectada, CTC y NTC usando una célula de ARN y kit de purificación fi tejido (Gentra SystemsUSA).

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cDNA fue sintetizado a partir de cada preparación de RNA utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen), y el ARN total (500 ng) se trató con 0,5 U de desoxirribonucleasa I (ADNasa I; Invitrogen) para digerir el ADN genómico. El SOX9 genes, IGF-I y el gen constitutivo gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron fi cador ed mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores especí fi cos (Tabla 1). Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (Invitrogen) y se tiñeron con 5 ml de bromuro de etidio a una concentración de 0,5 mg / ml (Sigma-Aldrich Co.). Los productos de PCR se visualizaron en un sistema de documentación de gel (UVP, Modelo M-26E; EE.UU.). Un análisis densitométrico se realizó con el software Phoretix 1D (TotalLab Ltd., Reino Unido; disponible online: ohttp: //www.totallab.com/1d-downloads/4). La densidad de cada banda se expresó como un valor normalizado a la densidad media banda GAPDH cDNA en cada gel. La densidad de las bandas de ADNc se expresaron como el número total de píxeles, y el nivel de expresión de ARNm se asumió que era equivalente a la densidad de las bandas respectivas.

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