TÉCNICAS EMPLEADAS EN LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Y ACIDOS NUCLEICOS

TÉCNICAS EMPLEADAS EN LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Y ACIDOS NUCLEICOS

PROTEINAS

Las proteínas desempeñan una amplia variedad de funciones en los mamíferos. Entre las funciones dinámicas se encuentran la catálisis, de las transformaciones químicas, el transporte, el control metabólico y la contracción. En cuanto a sus funciones estructurales las proteínas proporcionan la matriz para los tejidos óseo y conjuntivo que dan estructura y forma al organismo humano.

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, las diversas propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés se usan para separarla de manera progresiva de otras sustancias. Algunos de los procedimientos que se plantean a continuación y las características de la proteína de las cuales dependen son los siguientes:

Característica de la proteína Procedimiento de purificación

Solubilidad Disminución de la solubilidad

Carga iónica Cromatografía de intercambio de iones

Electroforesis

Isoelectroenfoque

Polaridad Cromatografía de interacción hidrófoba

Tamaño Cromatografía por filtración en gel

SDS – PAGE

Ultracentrifugación

Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

Separación de proteínas basada en solubilidad

1. Disminución de la solubilidad

La sal elegida, en general sulfato de amonio, se agrega a la solución de macromoléculas en una concentración justo por debajo del punto de precipitación de la proteína de interés (a). Luego de la centrifugación, las proteínas no deseadas que precipitaron se descartan y se agrega más sal al sobrenadante en una concentración suficiente para precipitar la proteína deseada (b). Después de una segunda centrifugación se recupera la proteína como precipitado y se descarta el sobrenadante (c).

Separación de proteínas basada en la carga iónica

1. Cromatografía de intercambio de iones

Se utiliza para la separación preparativa de proteínas basada en su carga. Las resinas de intercambio iónico consisten en materiales insolubles (agarosa, poliacrilamida, celulosa y vidrio) contienen grupos cargados. Las resinas cargadas negativamente fijan fuertemente los cationes y se conocen como resinas de intercambio catiónico. Las resinas cargadas positivamente fijan fuertemente los aniones y se denominan resinas de intercambio aniónico. El grado de retardo de una proteínas (o de un aminoácido) en una resina depende de la magnitud de la carga de la proteína al pH de experimento. Las moléculas con la misma carga que la resina se eluyen primero en una banda única, seguidas por las proteínas con carga opuesta a la de la resina, que se eluiran en un orden basado en la densidad de carga de la proteína. Cuando es difícil eluir una molécula unida a la resina debido a la fuerza de la interacción atractiva ente la molécula ligada y la resina, pueden utilizarse cambios sistemáticos de pH o de fuerza iónica para debilitar la interacción.

La región marrón de la columna representa el intercambiador de iones, y las bandas coloreadas, las proteínas. (a) Una mezcla de proteínas disuelta en un pequeño volumen de solución reguladora se aplica sobre la matriz de la columna. (b) A medida que se procede con la elución, las proteínas se separan en bandas como resultado de sus distintas afinidades por el intercambiador. En este diagrama la primera proteína (rojo) pasó a través de la columna y se aisló como una fracción separada. Las otras proteínas permanecen cerca de la parte superior de la columna. (c) Se incrementa la concentración de sales del eluyente para extraer las proteínas remanentes.

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