Técnica De Placas De Dulbecco, Titulación Del Los Virus Polio Y Herpes Simplex-1.

Técnica de Placas de Dulbecco, titulación del los virus Polio y Herpes Simplex-1.

INTRODUCCIÓN

Uno de los avances más importantes en la virología consistió en el ensayo en placa, el cual fue elaborado en el año de 1952 por el Dr. Renato Dulbecco, Virólogo italiano y premio nobel. (Aranda, 1987).

El método se basa en una suspensión de células la cual es colocada en placas; estas células se adhieren y crecen a lo largo y ancho de la superficie de vidrio u otro material sólido, hasta que forman una monocapa de células. Luego es eliminado el medio de cultivo y se añade una suspensión viral previamente diluida, el virus se desplaza de la célula infectada inicial a las adyacentes. Después es sometido a una breve incubación, este paso va a permitir que las partículas virales se adhieran a las células, se elimina el exceso de inoculo viral y se añade una capa de agar nutritivo, agarosa, metilcelulosa entre otros.

Después de una incubación que puede durar varios días (24, 48 y 72 horas), las células son sometidas a un proceso de tinción por medio de un colorante vital (rojo neutro) que solamente penetra en las células vivas tiñendo los lisosomas activos de la células, de manera que las muertas por causa de la infección viral permanecen incoloras y se manifiestan como placas desteñidas en la monocapa de células teñidas. (Aranda, 1987).

La técnica de placas de Dulbecco es una variante del Efecto citopatico (ECP), la infectividad viral se va a determinar localizando las lesiones celulares con ayuda de una capa mencionada anteriormente. Por lo tanto, se puede definir como el foco localizado de células infectadas por virus y que se origina a partir de una sola partícula viral. (Herrero et al., 2004).

El titulo de la semilla viral es calculado mediante diferentes diluciones donde las placas son contables y se saca un promedio de las mismas, el cual es multiplicado por el factor de dilución y se divide entre el volumen del inóculo, obteniendo así el título de unidades formadoras de placa por mililitro que es expresado como UPF/mL. (Fields et al., 2005)

La determinación de los títulos virales es de gran importancia para estudios virológicos y el método más utilizado es el ensayo de titulación de punto final, donde una monocapa celular es infectada con diferentes diluciones de un virus pudiéndose utilizar el punto final 50%, el cual es la dilución de la semilla viral que corresponde a la dosis letal para el 50% de los cultivos celulares. Se basa en la respuesta “todo o nada” es decir “vivos o muertos” (en este caso infectados o no infectados) sin que haya calificaciones intermedias. Las diluciones menores de virus contendrán más dosis infectantes que las mayores y entre ellas habrá un gradiente de actividad. Entonces se necesita determinar el 50 % de actividad y tomarla como dosis infectante 50 % (TCID50). Para llevar a cabo la interpolación del punto final 50% se utilizan dos fórmulas, la de Reed-Muench y la de Kärber (Herrero et al, 2004).

La titulación viral mediante la técnica de placas se considera en virología un método altamente cuantitativo y preciso para el análisis de la infectividad viral. Además permite estudiar en forma segura la capacidad neutralizante de agentes antivirales y de anticuerpos, y posibilita la purificación de un agente a partir del clonaje de sus placas. (Rodríguez., et al 1995).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Técnica de placas de Dulbecco

Se tomó una placa de 24 hoyos con cultivo de células Vero a las cuales se les revisó la confluencia de las monocapas, posteriormente se inoculó con una semilla viral de Herpes Simples-1 (HSV-1). A la cual se le hicieron diluciones seriadas con PBS 1X y rojo fenol estéril 1:10. Se tomaron 0.2 ml/hoyo de cada dilución por duplicado, para el control se utilizó PBS rojo fenol estéril, se incubó por una hora a temperatura ambiente, luego se decantó el inóculo y se agregó 1 ml de medio de placas que contenía MEM 1x + Penicilina-Estreptomicina 1X+SFB 2%+ agarosa 0.75%, se incubó a 37 ºC + 5% CO2 por 72 horas. Seguidamente se calculó el título según la fórmula (Herrero et al., 2010).

El título de la semilla viral se calculó con la siguiente fórmula:

UFP/mL= [(Promedio de placas por hoyo) x (Factor de dilución)]

(Volumen del inóculo)

Titulación de un virus por TCID 50/ml

Se tomó una placa de 24 hoyos, la mitad con células Vero para inocular Herpes Simplex-1 y la otra mitad con células Hep-2 para inocular virus Polio. Posterior a revisar la confluencia de la monocapa se inocula con diluciones seriadas de la semilla viral que se diluyó previamente a 10 -2 para virus HSV-1, con PBS 1X y rojo fenol estéril, se inoculó cada hoyo con 0.2 ml de cada dilución y para los controles se utilizó PBS 1X con rojo fenol estéril. Para el virus del polio se utilizó la dilución previa de 10-3 y se usó el mismo procedimiento. Se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y se procedió a descartar el inóculo, y se agregó 1 mL de MEM al 2%, se incubó a 37 ºC con CO2 al 5% por 72 horas. Seguidamente se descarta el contenido y se agrega 350 mL de cristal violeta durante 30 minutos y se lava la placa para realizar la lectura. El TCID50/ml se calculó según la fórmula propuesta por Kärber:

log TCID50 = L – d (S – 0.5)

Donde “L” es el logaritmo de la dilución más baja en la prueba, “d” es la diferencia entre los logaritmos de las diluciones y “S” es la suma de las proporciones de las pruebas positivas, es decir, las que presentan efecto citopático. (Herrero et al., 2010).

Resultados

Se realizó la determinación del título de la semilla viral de HSV-1 por el método de placas de Dulbecco. Los resultados obtenidos muestran que se obtuvo un promedio de 3.5 placas para una dilución de 10-4. Con estos resultados y utilizando la fórmula para la determinación del UFP/µL se obtuvieron 175 UFP/µL.

Durante la Títulación Viral, se observaron las células por un período de 72 horas, revisándolas al microscopio invertido cada 24 horas, se obtuvieron los porcentajes de confluencia y se observó el Efecto Citopático (ECP) presente en las células.

Para el Virus de Herpes Simplex 1 (HSV-1) se observó (Ver Cuadro 1) que el porcentaje de confluencia tuvo una disminución importante en las primeras 48 horas para las diluciones de 10-2, 10-3 y 10-4, el cuál continuó disminuyendo

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