DETERMINACION DE BACTERIA ACIDOFILAS MEDIANTE LA TECNICA DE RECUENTO EN PLACA

Elaborada por: Juan Pablo Hernandez- Esteban Sanabria- Roberto Gerena

1. INTRODUCCION

Existe una gran variedad de bacterias productoras de ácido en la naturaleza, suelo, materia prima y ciertos alimentos procesados. Uno de los grupos más importantes son materia prima y ciertos alimentos procesados. Uno de los grupos más importantes son las bacterias ácido lácticas. Los miembros de este grupo son cocos o bacilos Gram-positivo, no esporulados, que se dividen en un plano con excepción de los pediococos y catalasa negativa, con excepción de algunos pediococos. Microorganismos generalmente no móviles y fermentadores obligados que liberan ácido láctico y algunas veces, además, ácidos volátiles y CO2. Están subdivididos en los géneros Streptococcus (cambio propuesto de nomenclatura a Lactococcus), Leuconostoc Pediococcus y Lactobacillus. Las especies homofermentativas producen ácido láctico a partir de los azúcares, mientras que los tipos heterofermentativos producen además de ácido láctico, ácido acético, etanol, CO2, y otros componentes traza. Las bacterias ácido lácticas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y son bien conocidas en la industria láctea, cárnica y de los vegetales.

2. OBJETIVOS

 Determinar la presencia de bacterias acidofilas mediante la técnica de recuento en placa en profundidad.

 Este método es aplicable a cualquier alimento en forma líquida o sólida así como en el cual los microorganismos están viables y presentes.

3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

 Pipetas estériles graduadas de 1,0, 5.0 y 10,0 mLa

 Balanza con capacidad de 2000,0 g y sensibilidad de 0,1 g

 Baño de agua 45 ± 2ºCa

 6 Cajas de Petri

 Incubadora de 35 ºC con termostato calibrado que evite variaciones mayores a ± 0,2 °C

 Utensilios, estériles para el manejo de la muestra

 Cuenta colonias

 Microscopio, cubre y portaobjetos

 Agua peptonada

 Agar MRS acidificado

 2 Tubos de ensayo tapa rosca

4. PROCEDIMIENTO

 Preparar placas entre las diluciones 1 y 6 (ej. 10-1 10 -2 10 -4 y 10 -6).

 Pesar 25,0 g ( mL) del alimento.

 Añadir 225,0 mL de diluyente de peptona y licuar durante 2 min. Para líquidos no viscosos, agitar la muestra y sembrar 1,0 mL directamente o hacer diluciones seriadas

 Pipetear por duplicado, 1,0 mL de homogenizado y de cada dilución seleccionada en cajas petri.

 Verter 12,0 -15,0 mL de medio MRS fundido y enfriado (45 ± 2ºC) en cada caja de Petri. Mezclar cuidadosamente cada placa y dejar solidificar en una superficie horizontal

 Verter una sobrecapa delgada de 5,0 – 8,0 mL de agar MRS y dejar solidificar. La sobrecapa se utiliza para producir una atmósfera de oxígeno reducido.

 Incubar las placas en posición invertida a 35 ± 2ºC durante 5 días.

 Examen microscópico

 Colocar una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos limpio. Tocar una colonia con el asa recta y transferirla a la gota de colorante. Cubrir con cubreobjetos y observar a 400 x (objetivo de 40 x y ocular de 10 x).

 Las células aparecen azules. Las levaduras se tiñen de azul al igual que las bacterias.

5. FUNDAMENTO MEDIO DE CULTIVO

El contenido de peptona, extracto de carne y de levadura proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. El polisorbato 80, el magnesio y manganeso actúan favoreciendo el crecimiento óptimo de los Lactobacilos. La dextrosa es la fuente de energía. El fosfato de sodio ayuda a controlar el pH. El acetato de sodio junto con el valor del pH del medio de cultivo inhiben considerablemente

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