Técnica de tinciones bacterianas

PRACTICA 3

Técnica de Tinciones Bacterianas Abril-septiembre 2014

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Dr. Cesar Padilla Martínez – Docente de Cátedra.

1. Fundamentos de la practica

2. Taxonomía

3. Preparación del extendido para la microscopia óptica.

4. Coloración gram

5. Procedimiento.

6. Observación de la tinción de gram.

7. Tinción de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (frotis indirectos).

8. Coloración de Zhiel-Neelsen

9. Baciloscopía y su aplicación clínica

10. Procedimiento.

11. Observación de Bacterias BAAR.

12. Utilidad clínica

RESULTADO DE APRENDIZAJE: Saber cuándo pedir e interpretar los resultados de las coloraciones de la pared bacteriana

OBJETIVO:

 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram y Bacilos Alcohol-Acido Resistentes

 Reconocer los microorganismos Bacilo alcohol-acido resistentes y Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).

La coloración de Ziehl- Neelsen fue descrita por primera vez en 1881 por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo, para identificar paredes celulares de ciertas bacterias que contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente.

Taxonomía

Todos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el género seguido por la especie (es decir, el Homo sapiens). Las bacterias se han agrupado y denominado principalmente en su morfológicas y bioquímicas / metabólicas diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora también clasificadas de acuerdo a su inmunología y las características genéticas. Las tinciones las cuales permiten al médico - clínico determinar rápidamente el organismo que está causando la infección de un paciente.

PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO PARA LA MICROSCOPIA OPTICA

En la preparación de los extendidos se utilizan en forma directa las muestras del paciente o se aplican los microorganismos desarrollo de cultivos.

Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig 1). El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es líquida), o se rota de adentro a fuera (si está en un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un largo aproximado de 2 cm por 1 cm de ancho.

Es importante evitar la contaminación de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos ya no estéril, no debe utilizarse para la inoculación posterior de medios de cultivo.

Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos que previamente le realízanos un circulo con lápiz graso, este material se emulsiona en una gota de agua destilada o solución salina 0.9% estéril sobre el portaobjeto, se deja secar y se fija al portaobjeto mediante:

1).- una platina caliente (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos

2).- cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto o

3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones

Para examinar los microorganismos que crecen en líquidos corporales se aplica una gota de la muestra aspirada sobre el portaobjetos, se seca y se fija. No obstante la regla general para la preparación de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por último, el método de tinción que se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.

COLORACION GRAM

Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la microscopía de luz, diferentes técnicas de tinción se han desarrollado para visualizarlas. La más útil es la tinción de Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.

Esta tinción también permite que el clínico pueda determinar si el organismo es:

Forma: redondo o en forma de varilla, etc.

Agrupación: racimos, cadenas, etc.

Reacción de gram: positiva o negativa,

Cantidad: 1, 2, 3, etc. x campo o +, ++, +++, ++++

Elementos acompañantes: PMN, eritrocitos, detritus, células, etc.

Ambos organismos, gram-positivas y gram-negativas tienen más que una capa de protección de su citoplasma y núcleo desde el medio extracelular, a diferencia de las células animales, que tienen una sola membrana citoplasmática compone de una bicapa de fosfolípidos. La capa externa de la membrana citoplasmática bacteriana es el peptidoglicano o pared celular. Está presente en ambos organismos gram-positivos y gram-negativas.

La capa de peptidoglicano o pared celular está compuesta de repetidos disacáridos con 4 aminoácidos en una cadena lateral que se extiende desde cada disacárido.

Las cadenas de amino-ácidos del peptidoglicano se unen covalentemente a otros aminoácidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable estructura reticulada. La enzima que cataliza la formación de esta unión Se llama transpeptidasa y está situado en el interior citoplásmica membrana. El antibiótico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta razón, la enzima es también llamada proteína de unión a la penicilina.

La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son:

• Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., clamidias).

• Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).

• Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas).

• Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

MATERIALES:

 Portaobjetos

 Cubreobjetos

 Asas de inoculación

 Mechero Bunsen

 Pipetas

 Hisopos

 Colorantes

 Solución salina

PROCEDIMIENTO:

El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol.

Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos. La decoloración distingue las bacterias grampositivas de las gramnegativas. Después de la decoloración los microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo pierden. El agregar colorante de contraste safranina (Contratinción) teñirá de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras.

PRINCIPIO:

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron

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