Producción de hormona del crecimiento bovino por Pichia pastoris
Enviado por chueki • 29 de Septiembre de 2014 • 307 Palabras (2 Páginas) • 162 Visitas
Producción de hormona del crecimiento bovino por Pichia pastoris
Las hormonas del crecimiento o somatotropinas presentan una familia de proteínas producidas en los somatotropos de la hipófisis anterior. La primera hormona del crecimiento purificada fue la bovina a partir de hipófisis.
La hormona del crecimiento bovino es un polipéptido de 190 residuos aminoácidicos, construida por cuatro hélices alfa y cuatro cisteínas involucradas en los dos enlaces disulfuro que participan en la estabilidad de la estructura tridimensional de la hormona.
La disponibilidad de las somatotropinas bovinas ha permitido numerosos estudios de laboratorio y de campo. El impacto en los animales tratados se da en el incremento de la producción lechera y en el aprovechamiento del alimento.
Los objetivos del trabajo fueron la construcción de clonas de Pichia pastoris productores de hormonas de crecimiento bovino y de evaluar su capacidad de producción.
Material y métodos
Para la PCR se utilizó DNA polimerasa Pfu con actividad correctora, posteriormente se purifico el producto de la PCR para eliminar la Pfu, dNTPs, oligonucleótidos, reactivos y fragmentos menores a 200 nucleótidos. Luego, se dirigió dicho producto amplificado, junto con la DNA circular del vector pPIC9hGH22k, con las enzimas de restricción Xho I y Avr II.
Despues se comprobó por análisis electroforético que la digestión del vector fuera total, se aplicó una extracción y una precipitación. Se ligaron los fragmentos con la enzima DNA ligasa. Posteriormente el producto de la ligación se transformó en bacterias calciopotentes, las cuales fueron sembradas en placas con medio LB mas ampicilina e incubada a 37°C.
En estas placas se observó el crecimiento a la 18 hrs y fueron resembrados en tubos que contaban con medio LB y antibiótico y se les incubo por 18 hrs y 37°C. transcurrido el tiempo se sometirton a extracción de ADN selectivo. Una vez comprobada la integridad nucleica se transformo la levadura metilotrófica Pichia pastoris, empleando la técnica de esteroplastos (Iinvitrogen).
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