Curvas de titulacion de aminoacidos

EXPERIMENTO 3

CURVAS DE TITULACION DE AMINOACIDOS. DETERMINACION DE VALORES DE pK

REQUISITOS

Repasar los conceptos sobre las propiedades de los aminoácidos (AA), reacciones ácido base, pH, pK, soluciones amortiguadoras, representación gráfica y el ejo del pH-met man ro.

OBJETIVOS

Titular con NaOH y con HCl diversos aminoácidos (glicina, ácido aspártico, arginina), a fin de determinar el número de funciones ionizables, y el valor pKa y pKb de cada función

1. FUNDAMENTOS

Las propiedades de los aminoácidos, constituyentes fundamentales de las proteínas, radican principalmente en su comportamiento ácido-básico. En efecto, los aminoácidos presentan al menos dos grupos ionizables, como se puede apreciar en su fórmula general (figura 1).

Figura 1 Formula general de los aminoácidos

H H O

| | ||

N—C—C

| | |

H R OH

(b) (R) (a)

La función (a) que se llama grupo carboxilo se encuentra protonada a pH ácido y pierde un protón a pH neutro (con la aparición de una carga negativa) según la ecuación siguiente (figura 2).

Figura 2. Funciones ácido y base conjugada de los aminoácidos

ácido base conjugada

(AH) (A-) + H+

O O

|| ||

—C—OH ⇔ —C —O

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Esta función química está caracterizada por su constante de ionización (Ka), es decir, la constante de equilibrio de la reacción de ionización (figura 3).

Figura 3. Constante de equilibrio de la reacción de ionización

(A-) (H+)

Ka1 = ————————

(AH)

Sabiendo que: Podemos escribir:

pKa = - log Ka

pH = - log (H+)

(A-)

pKa = pH - log ———

(AH)

En la práctica una ionización se define por el valor de pKa, que corresponda al valor de pH en el cual hay igual concentración de (A-) y de (AH), o sea 50% de cada uno. El pKa de una función carboxilo tiene en general un valor entre 2 y 4.5.

La función (b) se llama amina. (figura 4). Se presenta en forma protonada (con carga positiva) a pH neutro y ácido, pierde un protón a pH muy básico (sin mostrar carga).

Figura 4. La función (b) amina.

Ka2

- N+H3 ⇔ -NH2 + H+

El pKa de una función amina se encuentra generalmente entre 8 y 11. En la práctica se puede comprobar que una molécula se puede ionizar al titularla con NaOH.

Primero es necesario llevar el pH alrededor de 1.5-1.8 luego se agrega lentamente cantidades conocidas de NaOH y se mide después de cada adición el pH obtenido. Por Ejemplo, el ácido acético CH3COOH da una curva de titulación de este tipo (figura 5).

En esa curva se puede observar que al agregar NaOH el pH cambia rápidamente al principio y luego se estabiliza de tal manera que casi no varía al agregar más NaOH (zona plana). Después de esta región de estabilización ocurre un cambio brusco de pH por adición de más NaOH.

La región "estable" es una sigmoide, cuyo centro se encuentra a un pH correspondiente al valor de pKa.

Una molécula ionizable se caracterizará siempre por un pKa y también por un rango de pH (pKa -1< pH < pKa + 1) en el cual toda variación de pH será amortiguada.

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Esa zona se llama zona de tamponamiento. Todas las moléculas ionizables servirán entonces de tampón alrededor de un valor del pKa.

Se puede escribir las fórmulas ionizantes o iónicas del ácido acético en función de la curva:

1. El valor del pKa corresponde a un equilibrio 50%-50% entre CH3COOH y CH3COO-.

2. Al comenzar la titulación, antes de la zona plana tenemos CH3COOH.

3. En la parte que cambia bruscamente después de la zona plana tenemos CH3COO-.

Figura 5. Curva de titulación del ácido acético

En resumen, por debajo del valor de su pKa (por lo menos de 2 unidades de pH) una molécula ionizable se encuentra casi todo en forma protonada, mientras que por encima de ese valor, se encuentra en su forma no protonada.

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El caso de los aminoácidos (AA) es algo más complicado, puesto que hay 2 funciones ionizables. Eso se va a traducir en curvas de titulación multifásicas. (figura 6)

Sobre la base de las propiedades iónicas que poseen los grupos R de los aminoácidos, constituyentes de las proteínas, se han desarrollado métodos de separación cuantitativa a partir de mezclas complejas, como un hidrolizado de proteínas.

El estudio sistematizado de estas propiedades, ha significado progresos importantes en el conocimiento detallado de la estructura de las proteínas, métodos como la cromatografía y la electroforesis, que han permitido un análisis más rápido, preciso y actualmente: automatizado.

Figura 6. Curva de titulación del aminoácido alanina (ALA)

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2. MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1 Equipos. 2.2 Reactivos.

pH-Metro. Aminoácidos.

Tubos de ensayo. NaOH 0.5 N

Pipetas. HCl 0.5 N.

Balones aforados.

Fiolas.

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