Una novela FMR1 método PCR para la detección rutinaria de baja abundancia Ampliado alelos y Full Las mutaciones en el Síndrome X Frágil

Una novela FMR1 método PCR para la detección rutinaria de baja abundancia Ampliado alelos y Full Las mutaciones en el Síndrome X Frágil

Abstracto

Antecedentes: el síndrome del cromosoma X frágil (FXS) es una enfermedad causada por la repetición de trinucleótidos la expansión de secuencias CGG en la región 5 'no traducida del FMR1 (1 retraso mental X frágil) de genes. Diagnósticos moleculares de FXS y otros emergentes FMR1 trastornos normalmente se basan en 2 pruebas, PCR y Southern Blot;sin embargo, el rendimiento o rendimiento limitaciones de estos métodos actualmente limitan las pruebas de rutina.

Métodos: Se evaluó una novela FMR1 tecnología PCR-gen específico con las plantillas de ADN de 20 líneas celulares y 146 muestras clínicas cegados. El número de repeticiones CGG se determinó por fragmento de dimensionamiento de amplicones de PCR con electroforesis capilar, y los resultados se compararon con los de FMR1 análisis de transferencia de Southern con las mismas muestras.

Resultados: El FMR1 PCR detectan con precisión alelos-mutación completa hasta al menos 1300 CGG repeticiones y que consiste en> 99% carácter GC. Todas las categorías de alelos detectados por transferencia de Southern, incluyendo 66 muestras con mutaciones completas, también se identificaron por el FMR1 PCR para cada una de las 146 muestras clínicas. Debido a que todos los alelos de mutación de pleno derecho en las muestras de mujeres heterocigotas fueron detectados por el PCR, cigosidad alelo se reconcilió en todos los casos. Los reactivos de PCR también detectó una fracción de 1% en masa de un alelo 940-CGG en un fondo de 99% 23-CGG alelo de un más o menos 5 veces mayor sensibilidad que la obtenida con la transferencia Southern.

Conclusiones: La nueva tecnología de la PCR puede clasificar con precisión el espectro deFMR1 alelos, incluyendo alelos previamente considerados demasiado grandes para amplificar; detectar reproducible baja abundancia alelos mutación completa; e inferir correctamente homocigosis en muestras de mujeres, lo que reduce considerablemente la necesidad de la muestra reflexing de transferencia de Southern.

El síndrome X frágil (FXS), 1 la forma más común de deterioro mental hereditario y la causa conocida genética del autismo, fue una de las primeras enfermedades humanas para vincularse a una expansión de repeticiones de nucleótidos triplete ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ).FXS es causado por la expansión de la secuencia de repetición CGG localizado en la región no traducida 5 'del FMR1 (retraso mental X frágil 1) gen ( 2 ). Los individuos con "normal" (<45 repeticiones CGG) o intermedio (45-54 repeticiones CGG) FMR1 alelos se cree actualmente para ser asintomáticos para los trastornos asociados con el FMR1 gen;Sin embargo, los individuos que son portadores de un alelo premutación (55 a 200 repeticiones CGG) pueden desarrollar el síndrome de temblor / ataxia X-frágil asociado ( 5) o insuficiencia ovárica primaria X-frágil asociado ( 6 ​​) ( 7 ) ( 8 ), mientras que los individuos con el FMR1 mutación completa (> 200 CGG repite) suelen tener FXS ( 9 ).Nada menos que 1,5 × 10 6 personas en los EE.UU. se cree que estar en riesgo de al menos un FMR1 trastorno ( 10 ). Por lo tanto, estas enfermedades son clínicamente importantes y afectan a una amplia gama de poblaciones y edades.

Actualmente, la mayoría de los paradigmas de diagnóstico de prueba para FMR1trastornos se basan en la PCR con la resolución tamaño por electroforesis capilar (CE), electroforesis en gel de agarosa (AGE), o PAGE para la resolución de tamaño para la detección de hasta 100-150 CGG repite. FMR1 Sur El análisis de transferencia se utiliza tanto para caracterizar muestras con los números de repeticiones CGG demasiado grande para amplificar por la PCR y para determinar el estado de metilación del gen de ( 11 ).Desafortunadamente, este flujo de trabajo es costoso, es el tiempo y mano de obra intensiva, y requiere grandes cantidades de ADN genómico (gDNA), lo que es inadecuado para los volúmenes de ensayo más altas o cribado de la población. La PCR tiene el potencial de abordar cada una de estas limitaciones, sin embargo, el carácter altamente rica en GC de la secuencia de repetición de triplete-X frágil históricamente ha sido refractaria a la amplificación. Tales innovaciones PCR como el uso de adyuvantes osmolíticas, nucleótidos modificados y ciclismo condiciones específicas han mejorado la detección de hasta aproximadamente 300 a 500 repeticiones CGG ( 12 ) ( 13 ), sin embargo, incluso esta actuación sería un fracaso para detectar muchos, si no la mayoría, completo alelos de mutación ( 14 ). Es importante destacar que el análisis de PCR de muestras de premutación y mutación completa hembras ha sido mucho menos éxito debido a la amplificación preferencial del alelo menor ( 12 ). En consecuencia, el> 20% de las muestras femeninas que son homocigotos debe reflexed a análisis de transferencia de Southern para resolver la ambigüedad potencial de un unamplified alelo más tiempo.

Se describe el funcionamiento de una novela de genes específicos de FMR1 tecnología PCR que puede resolver muchos de los desafíos tecnológicos que ahora limitan las pruebas de X frágil rutina. Este método reproducible amplifica alelos con repeticiones CGG> 1000 y demostró una excelente concordancia con transferencia de Southern en una evaluación de las muestras clínicas con FMR1 alelos que se extendió por toda la gama de CGG repite. La consistencia y la sensibilidad de los reactivos para detectar alelos premutación y mutación completa, incluyendo especies de mosaico que pueden estar presentes en sólo un pequeño porcentaje de las células, también resuelto ambigüedades en la identificación de muestras de hembras homocigóticas que pueden confundir convencionales FMR1 ensayos de PCR. Detección reproducible de los alelos mutación completa por parte de la PCR tiene implicaciones para la adopción más amplia de FMR1análisis.

Sección anteriorSección siguiente

Materiales y METODOS

Las muestras de ADN clínicos y de líneas celulares

Las muestras de sangre fueron obtenidas de individuos evaluados en la Clínica Instituto MIND después de haber dado su consentimiento informado y de acuerdo con un protocolo de la Junta de Revisión Institucional aprobado. gDNA fue aislado a partir de leucocitos de sangre periférica (5 ml de sangre completa) con métodos estándar (Kit de Sangre Puregene Gentra; Qiagen). Sólo el número de código era conocido por el técnico que maneja las muestras. Un total de 146 muestras codificadas fueron enviados a Asuragen para el análisis de PCR. Todas las muestras de ADN de líneas celulares se obtuvieron de Repositorios Coriell Cell (Instituto Coriell para la Investigación Médica). Muestras de ADN clínicos y la línea celular se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) y se diluyeron a 20 ng / l en 10 mmol / L Tris, 0,5 mmol / L de EDTA, pH 8,8, antes de la PCR.

Todos los lotes de muestras de PCR incluyen al menos una línea celular "control del proceso." Agrupada El control del proceso se genera a partir de 4 muestras-NA20239 línea celular (10 ng / l), NA07541 (5 ng / l), NA20230 (12 ng / l) , y NA06891 (10 ng / l), es decir se mezclaron en agua desionizada. El uso de este control produce picos de productos de PCR 6 correspondiente a 20, 29, 31, 54, 119, y 199 repeticiones CGG que podrían ser detectados en un único capilar. Amplicones alelo para 29, 54, y 119 repeticiones CGG fueron verificadas directamente por secuenciación de ADN, y amplicones para los de 20 y 31-CGG repeticiones fueron emparejados con el tamaño de pares de bases de los alelos verificados secuenciados. En cada uno de estos casos, la desviación desde el resultado de la secuenciación fue de menos de una sola repetición CGG. La longitud de repetición del alelo 199-CGG fue inferida por esta línea celular a partir de la calibración del sistema a los primeros 5 alelos. Por último, la reproducibilidad de la detección para cada uno de los 6 alelos de control de proceso produce una SD de menos de una sola repetición CGG a través de 12 carreras CE independientes.

Para evaluar la sensibilidad analítica de PCR y transferencia de Southern, hemos preparado una muestra de control heterocigotos hembra mock mezclando el ADN aislado de muestras de 2 líneas celulares, NA06895 (23 repeticiones CGG) y NA09237 (940 CGG repite). Estos aditivos conservan la misma entrada de masa en cada caso, 7 g de transferencia de Southern y 40 ng para la PCR, mientras que el porcentaje en masa del alelo 940-CGG se varió de 1% a 100%.

específicos de gen FMR1 PCR

Las muestras se prepararon para la PCR con una mezcla maestra de Asuragen contiene 11,45 l GC-Rich AMP Buffer, 1,5 l de 6-carboxifluoresceína (FAM) marcado con FMR1cebadores, y 0,05 l GC-Rich Mix polimerasa. Los cebadores fueron FMR1 Forward (TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A) y FMR1 inversa (FAM-AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC). La mezcla maestra era vórtice mixta antes de dispensar en una placa de microtitulación (96 o 384 pozos; Phenix Research Products). Las alícuotas de la muestra de ADN, típicamente de 2 l a 20 ng / l, se transfirieron a la placa. Placas selladas (ABGene de aluminio; Phenix Research Products) eran-vórtice mezclado, se centrifugó, y se transfirió a un ciclador térmico (ABI 9700; Applied Biosystems). Las muestras se amplificaron con un paso de calor de desnaturalización inicial de 98 ° C durante 5 min; 25 ciclos de 97 ° C durante 35 s, 62 ° C durante 35 s, y 72 ° C durante 4 minutos; y una final de extensión a 72 ° C durante 10 min. Después de la PCR, las muestras se almacenaron protegidos de la luz a -15 ° C a -30 ° C antes de su análisis por la edad o de la CE. Un esquema para la tecnología y el trabajo de flujo se muestra en la Fig. 1 ⇓ .

...