Laboratorio de Bioconversiones

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Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería campus Guanajuato.

Ingeniería Biotecnológica

Laboratorio de Bioconversiones

Práctica 1.

Curvas de calibración para proteínas y azúcares reductores.

Equipo 2

4BV1

Integrantes:

Conejo Dávila, Efraín

Herrera Ibarra, Evelyn

Ochoa Arroyo, Ana Paula

Terrones Hernández, Christian Alberto

Cortés Cañamar, Yordan

Silao de la Victoria, Guanajuato,  5 de febrero de 2019.

RESUMEN

En el siguiente reporte se presentan las curva de calibración en soluciones de albúmina de huevo ) y glucosa  por medio de los métodos de Bradford y DNS respectivamente, donde se muestra  la relación entre la concentración y la absorbancia medida, haciendo uso de un espectrofotómetro UV- Vis. A partir de la curva de calibración y a fin de asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo matemático de la ecuación  y = mx + b; se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinación de .[pic 3][pic 4][pic 5]

INTRODUCCIÓN

Durante años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e infrarrojo, dado que cualquier enlace químico absorbe y emite energía a una determinada longitud de onda. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la Ley de Beer-Lambert (Harris, 1982).

La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra. La expresión matemática de la ley de Lambert-Beer es:

                                                                   

Donde:
A=Absorbancia de la muestra
C=Concentración del cromóforo
L=Longitud del paso óptico que contiene la muestra[pic 6]

=Absortividad molar. Depende del cromóforo en sí mismo, de la  y de las condiciones de medida (pH, T...). Ya que la absorbancia es adimensional las unidades son concentración-1 longitud-1.[pic 7][pic 8]

En óptica, La ley de Beer afirma que la totalidad de luz que emana de una muestra puede disminuir debido a tres fenómenos de la física:
1. El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se denomina concentración
2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de las muestra. Denominamos a este fenómeno, distancia del trayecto óptico
3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de onda pueda absorberse por el material. Esto es la absorbancia o también coeficiente de extinción.

La principal aplicación de la espectrofotometría es la de medir la absorbancia de la luz a través de un aparato espectrofotómetro, que es un instrumento que se usa para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra (Hernández, 2002).

La cantidad de una sustancia química conocida (concentraciones) también puede determinarse midiendo la intensidad de la luz detectada. Dependiendo del rango de longitud de onda de la fuente de luz, se puede clasificar en dos tipos diferentes:

1. Espectrofotómetro UV-Vis: utiliza luz en el rango ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) del espectro de radiación electromagnética.
2. Espectrofotómetro de infrarrojos: utiliza luz en el espectro de infrarrojos (700 – 15,000 nm) del espectro de radiación electromagnética.

Ahora bien el equipo y funcionamiento de este es solo una parte de la ecuación, otra parte igual de relevante, es la capacidad de conocer la absorción de longitud de onda  de los enlaces específicos que tenga nuestro analito.

Para ello se han desarrollado técnicas de tinción y acomplejamiento, que generan moléculas con estructuras específicas, con enlaces que absorben y emiten a cierta longitud de onda, así evitando el aporte erróneo a la lectura, por moléculas diferentes.

En la siguiente práctica se determinó la concentración de proteínas y azúcares reductores.

Determinación de proteínas:

Las proteínas son sustancias complejas formadas necesariamente por los elementos: C, H, O, N, S y en algunos casos fósforo. Son de alto peso molecular, forman dispersiones coloidales y están compuestas por L-alfa-aminoácidos en enlace peptídico, arreglados en secuencia lineal que se arrolla después para constituir cuatro niveles estructurales. Las proteínas se encuentran presentes en todas las estructuras de la célula y son las moléculas más activas en la vida celular. Una de las funciones más relevantes de las proteínas es constituir la parte fundamental de las enzimas, los principales catalizadores de las células (Voet,2006).

Los métodos más comunes son:

ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
Rango de concentración: 20-2000 µg/ml

Características:

Desarrollado en 1985. Ensayo colorimétrico donde la absorbancia será proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra

Reacción en dos pasos:
1.  Formación de complejos proteína-iones de cobre.
2. Formación de un quelato Cu-BCA que da lugar a una intensa coloración púrpura que absorbe a 562nm.

Es un método recomendado en el caso de muestras que contengan >5% de detergentes y/o agentes desnaturalizantes como urea o cloruro de guanidinio.

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