Historia De Honduras

PROCESO PEHR VICTOR EDMAN

Edman estaba muy interesado en la determinación detallada de la estructura de las proteínas y con su método consiguió dar lugar a una explicación estructural de sus diversas actividades biológicas. Para su doctorado, Edman aisló de la sangre bovina una proteína pequeña que regula la presión arterial (Angiotensina), pero pronto se dio cuenta de que las proteínas están constituidas por pequeños “bloques o ladrillos”: los aminoácidos. Para dar una explicación estructural a las diversas actividades biológicas de las proteínas debía encontrar un método que le permitiera una determinación de la estructura de las mismas. A Edman se le ocurrió la fantástica idea de una serie de reacciones basadas en el acoplamiento del fenilisotiocianato (PITC) con una proteína purificada y el uso de hidrólisis ácida. Esta serie de reacciones le permitieron analizar las proteínas de forma secuencial, aminoácido por aminoácido, y así preservar la información lineal estructurales necesarias para interpretar su actividad biológica. El procedimiento de la degradación de Edman o secuenciación de Edman marca y elimina sólo el residuo N-terminal de un polipéptido, dejando el resto de enlaces peptídicos intactos. Para ello, se hace reaccionar el péptido con PITC eliminándose el residuo N-terminal en forma de derivado de fenilhidantoína (PTH). Después de la eliminación e identificación del residuo N-terminal mediante HPLC, el nuevo residuo N-terminal puede ser marcado, eliminado e identificado por repetición de la misma serie de reacciones. Este procedimiento se repite hasta que se ha determinado toda la secuencia

Debido a que se tienen que realizar muchos pasos de reacción y muchas determinaciones, normalmente hoy día éste método se lleva a cabo mediante analizadores automáticos o secuenciadores que mezclan los reactivos en las proporciones adecuadas, separa los productos, los identifica y registra los resultados. Visionario en su campo, Edman diseñó en 1961 un instrumento automático llamado “secuenciador de proteína para determinar la estructura de las proteínas mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos”, el primer secuenciador automatizado de proteínas.Edman continuó hasta su muerte trabajando para mejorar este método y así poder determinar cadenas más largas pero con menor material de partida.

METODO SANGER

En 1975, Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN conocido como método de Sanger. Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar el genoma del bacteriófago Phi-X174, el primer organismo del que se secuenció totalmente su genoma. Realizó este trabajo manualmente, sin ayuda de ningún automatismo. Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio Nobel en 1980, que compartió con Walter Gilbert.El método de secuenciación por dideoxinucleótidos, mejor conocido como el método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del DNA. El método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar alongándose. Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.

El método comienza una vez se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador o “primer” que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.

A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de

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