AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

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Univ.:            ROALNDO A Q[pic 2]

PRÁCTICA 6

AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

1. OBJETIVOS

        A. OBJETIVO GENERAL

Determinar el porcentaje de viabilidad celular y realizar ajuste de concentración celular.

        B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar el aislamiento de células polimorfonucleares por el Método Ficoll-Hypaque.
• Relacionar la viabilidad celular con la concentración celular.

2. RESULTADOS

        A. VIABILIDAD CELULAR

a. Método Ficoll-Hypaque[pic 3][pic 4][pic 5]

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• Cálculo del porcentaje de viabilidad celular

Datos:

# Células totales= 18

# Células viables= 18

# Células muertas= 0

% viabilidad celular= ?

                        b. Método perlas inmunomagnéticas[pic 24][pic 25][pic 26]

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• Cálculo del porcentaje de viabilidad celular

Datos:

# Células totales= 13

# Células viables= 13

# Células muertas= 0

% viabilidad celular= ?

        B. AJUSTE DE CONCENTRACIÓN CELULAR

a. Método Ficoll-Hypaque

Después del tratamiento con Ficoll-Urografina, se recupera de la interface, 3mL de polimorfonucleares, mismos que son  resuspendidos en 8mL de Solución fisiológica, posteriormente en 10mL se SF y finalmente en 500µL (0,5mL) de SF:

• Factor de dilución:
• # células vivas/mL (Ci) = #células contada vivas x 105

    =  18 x 106 = 1,8 x 106 cel/mL

*

• Ajuste de concentración celular[pic 45]

Datos: 

Ci= 1,8 x 106 cel/mL

Vi= 500µL

Cf= 2,5 x 106 cel/mL

Vf= ?

                b. Método perlas inmunomagnéticas

• Factor de dilución:

• # células vivas/mL (Ci) = #células contada vivas x 105

    =  13 x 1 x 104 = 1,3 x 106 cel/mL

• Ajuste de concentración celular[pic 46]

Datos: 

Ci= 1,3 x 106 cel/mL

Vi= 500µL

Cf= 2,5 x 106 cel/mL

Vf= ?

3. DISCUSIÓN

• Aislamiento de células.- Las soluciones de Ficoll-Hypaque consisten en un medio de polisucrosa y radiopaco, la cual está ajustada a una densidad de 1,077 (en nuestro caso trabajamos con una densidad de 1,080). Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará en el tubo de centrifugación de acuerdo a su densidad hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad. Las células Mononucleares permanecen entre el plasma y la solución HISTOPAQUE, mientras que los eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo, se realiza centrifugación para que las diferentes capas de densidad estén bien definidas y así extraer el anillo o capa correspondiente a las células polimorfonucleares.

En el caso de uso de microperlas inmunomagneticas, consiste en el empleo de anticuerpos monoclonales (AcMcs), unidos a perlas magnéticas; en esta, los anticuerpos específicos se conjugan con partículas magnéticas y se unirán a células que expresen el antígeno diana, la aplicación de un campo magnético atraerá las células hacia un imán, separándolas del resto de las poblaciones celulares.

Como se ha reportado en la literatura, la separación en gradientes de densidad se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los granulocitos. La densidad del Ficoll es mayor que la de los linfocitos, pero menor que la de los eritrocitos y los granulocitos. Durante la centrifugación, los eritrocitos y los polimorfos nucleares atraviesan el Ficoll se depositan en el fondo del tubo, mientras que los linfocitos quedan retenidos en la interface entre el plasma y el Ficoll, gracias a su densidad especifica. Este hecho pudo ser observado visualmente, observando la formación clara de tres fases.

• Viabilidad celular.- mide la proporción de células vivas; en la práctica para la determinación utilizamos el método de tinción con azul Tripan, Proporción-suspensión: tinte 1:1→ 10µL de colorante y 10µL de suspensión de células. El Azul Tripan es un colorante vital que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura o daño en la membrana plasmática; así, las células que aparecen en el microscopio de color azul, son consideradas no viables.

La cámara de Neubauer o Hemacitometro es utilizada generalmente para el conteo de células sanguíneas, pero también puede ser utilizado para el conteo de otros tipos celulares, esta cámara se adapta al microscopio óptico lo que nos permitirá realizar el conteo de células mononucleares  y así determinar el porcentaje de viabilidad celular.

La determinación de la viabilidad celular es importante debido a que las células polimorfonucleares son de vida corta (vida media aproximada de 6 a 8 horas) y el conocimiento de este aspecto es importante en caso de realizar estudios de citotoxicidad.

Ahora bien, finalizada la práctica, y después del conteo celular, obtuvimos un 100% de VIABILIDAD CELULAR; sin embargo, no se debe olvidar que el método utilizado es un método cualitativo, además que en el recuento celular hubieron muchas dudas al considerar o no una célula muerta, a pesar de ello, nos quedamos con el resultado arriba mencionado.

• Ajuste de concentración celular.- Para realizar este paso, es preciso contar con una viabilidad celular dentro del un rango de 90-100%, este rango fue obtenido (100%) y para el cálculo de la concentración celular o densidad celular utilizamos el Factor 105, producto de la utilización de la cámara de Neubauer. Además realizamos los cálculos necesarios para llegar a la concentración recomendada para realizar el trabajo que es de 2,5 x 106 cel/mL.

4. CONCLUSIONES

Con el desarrollo de la práctica logramos determinar el porcentaje de viabilidad celular y realizar ajuste de concentración celular utilizando el Método Ficoll-Hypaque y Perlas Magnéticas con ayuda de la cámara de Neubauer. Finalmente, relacionamos el porcentaje de viabilidad celular para hacer cálculos de la concentración celular deseada.

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