PRÁCTICA 1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”

SUBDIRECCIÓN ACADÉMICA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

ACADEMIA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INGENIERÍA DE BIORREACTORES

DOCENTE: MIGUEL ANGEL ZAMUDIO JARAMILLO

ALUMNO: GERARDO SEBASTIAN PRIMO LUGO

N° DE CONTROL: 18121308

PRÁCTICA 1

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

INTRODUCCIÓN

La determinación de la biomasa o concentración celular es uno de los parámetros más importantes a la hora de realizar un proceso de carácter biológico, esta determinación nos ayuda a identificar la eficiencia en dicho proceso. La biomasa es una variable clave cuando se busca encontrar tasas de consumo de nutrientes, crecimiento es por eso que existen métodos para determinar la biomasa y estos se clasifican en métodos directos y métodos indirectos; los primeros se basan en la determinación del peso celular o del número de células, mientras que los segundos estiman componentes celulares o de alguna actividad metabólica específica.

Métodos directos:

• Métodos gravimétricos
• Método de recuento en placa
• Método por sembrado
• Método espectrofotométrico

Métodos indirectos:

• Métodos fisicoquímicos
• Métodos bioquímicos
• Métodos cinéticos
• Componentes celulares

En la elaboración de la práctica se analizan dos de los métodos directos, el método espectrofotométrico donde su fundamento es la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos que se encuentran en una muestra y la turbidez de esta, es importante mencionar que este método es rápido, pero de baja sensibilidad y sus fallos generalmente radican en una correcta calibración, además de que puede haber presencia de otras partículas en la muestra que generen errores. (Arnáiz et. al. 2000). El método gravimétrico en términos de peso seco utilizando separación de células por filtración, este método tiene como desventaja que el peso obtenido no solo incluye células funcionales, si no también células  muertas, material inerte, polímeros extracelulares y otra materia orgánica adsorbida.

MATERIALES Y MÉTODOS

Inicialmente se prepararon 4 soluciones de levadura a diferentes concentraciones, utilizando 50ml de agua donde se agregó 0.01, 0.02, 0.03 y 0.04 g de levadura de panificación, una parte de estas soluciones se pasaron a celdas espectrofotométricas para conocer su absorbancia.

De cada uno de los recipientes se tomó 1 mL de suspensión y se hizo pasar por el filtro designado previamente pesado, posteriormente los filtros se extrajeron y fueron colocados en el secador por 4 horas, pasado este tiempo se pesaron y registraros dichos pesos para obtener la biomasa como peso seco.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de la determinación de peso seco por unidad de volumen (g/mL), siendo que el volumen analizado fue 1 mL, son los que se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados de determinación por método gravimétrico expresado en peso seco para cada suspensión.

Para realizar la curva de calibración que relaciona la absorbancia de las suspensiones con el peso seco relacionamos el peso seco vs la absorbancia obtenida para cada solución.

[pic 1]

Gráfico 1. Peso seco vs Abs

Se dio una solución problema con una abs de 0.475 y  cuyo peso seco es desconocido, con ayuda del gráfico anterior y una interpolación lineal se llegó al siguiente resultado de peso seco para la muestra problema:

De acuerdo a los datos, gráfico valores experimentales obtenidos con anterioridad se llegó al resultado de 0.0145 g/ml de peso seco para la muestra problema asignada.

Se observa que entre mayor era la concentración de las suspensiones utilizadas, mayor es el peso seco obtenido sucede ya que, entre mayor cantidad de levadura añadida, mayor número de células se encuentran en el medio, esto concuerda con los resultados obtenidos con los resultados obtenidos por González Flores (2017), en donde, a pesar de utilizar centrifugación y no filtración, se observa un aumento de peso seco con respecto a la concentración de C. glabrata y K. marxianus, del mismo modo, obtuvo valores de absorbancia crecientes conforme aumentaba la concentración de unidades formadoras (UFC/mL) de colonias en sus medios. Portillo Cuellar y Ramírez Martínez (2009) obtuvieron resultados de absorbancia que aumentaban conforme la concentración de B. subtilis aumentaba en su análisis, por lo cual se puede decir que los resultados obtenidos, así como los resultados de dichas investigaciones siguen la Ley de Beer.

Se debe considerar que, en cualquier análisis por método gravimétrico, el correcto manejo de las masas a determinar es fundamental para obtener resultados óptimos, es decir que las masas a determinar no deben ser manejadas directamente con las manos, deben prepararse a peso constante todos los instrumentos a utilizar y se deben registrar correctamente los pesos iniciales y finales. También, es importante tener en cuenta que una forma más eficiente de obtener el peso seco es mediante el uso de centrifugación en lugar de filtración como se describe por Portillo Cuellar y Ramírez Martínez (2009), en donde la masa concentrada de células resultante del centrifugado se seca directamente en estufa hasta obtener peso constante, sin necesidad de usar microfiltros.

Algunos factores que se pudiesen afectar los resultados que se obtienen en este método son la absorción de humedad atmosférica una vez que se ha secado la muestra, y esto pude suceder desde que se abre la puerta del secador para extraer las muestras, por lo que es conveniente trabajar en un espacio donde la humedad pueda ser controlada.

Para la determinación de biomasa por el método espectrofotométrico, se ha mencionado ya en la introducción que puede haber impurezas que afecten la absorbancia obtenida en esta prueba, por lo que se debe asegurar que el medio líquido (en este caso agua) esté ausente de impurezas que afecten los resultados.

Se establece una relación directa entre la masa de microorganismos con la masa de productos o reactivos de interés, ya sea para optimizar producción o el consumo, como es el caso en algunos tratamientos de sustratos contaminantes que pueden ser descompuestos por microorganismos evitando impactos ambientales graves.

Asimismo, se debe recordar que la determinación de la biomasa no solo consiste en la determinación de la cantidad de microorganismos, sino que también existen métodos indirectos que miden la cantidad de productos, reactivos o metabolitos secundarios que se relacionan directamente con el crecimiento de los microorganismos en un sistema de interés.

CONCLUSIONES

Durante esta experimentación se logró identificar que existen diversos métodos para obtener la cantidad de masa dentro de una muestra biológica, y que no solamente pueden identificar la cantidad de células presentes en la muestra, sino que, si el compuesto de interés es un metabolito, un sustrato o un producto este puede ser determinado como biomasa. Asimismo, se logró identificar que existe una relación inherente entre la masa contenida en las muestras analizadas y la turbidez de estas (Ley de Beer), haciendo una curva de calibración que permitiera determinar concentraciones diferentes dependiendo de la absorbancia obtenida o viceversa. A pesar de que los resultados obtenidos presentaron desviaciones notables, se pudo identificar la causa de estas y determinar cuáles son los factores más importantes por controlar si se requiere hacer un análisis similar en un futuro.

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