AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

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AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

Profesora: Alma Teresa Miranda Quiroz

Integrantes:

José Alfredo Cervantes Núñez

Alejandra Sarahí Méndez González

José María Martínez

Grado y grupo: 10°A Ingeniería en biotecnología

Introducción:

Los plasmidos son moléculas de DNA extracromosomal los cuales están presentes en algunas células bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado plàsmidos lineales. La replicación de los plasmidos es independiente de la replicación del cromosoma del huésped ya que los plasmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plasmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación. Los plàsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células que los poseen, dado a que los plasmidos poseen genes que le confieren características selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de virulencia y producción de toxinas entre otros. Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. Existen unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer para que sea un buen vector al aplicar su uso en la biología molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección (ya sea resistencia a algún antibiótico) y un lugar de clonaje múltiple (MCS). El MCS es una región donde pueden digerir varias enzimas de restricción pero solamente una vez. Existen diversos métodos para el aislamiento de plasmidos. Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de plasmidos, permiten la recuperación de plasmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuración superenrrollada del plasmido se mantiene estable. La lisis alcalina es el método mayormente utilizado para el aislamiento de plasmidos circulares proveniente de células bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos básicos.

a. Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.

b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del huésped.

c. Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.

d. Lisar las células con NaOH y SDS.

 e. Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de potasio.

 f. Precipitación del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).

g. Enjuague del material genético con EtOH al 70%. h. Resuspender el material genético.

(Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales , universidad de Santander)

MATERIAL

Puntas estériles

Pipetas automáticas

Camas y peines de electroforesis

Vaso de precipitado (para desecho).

Erlenmeyer de 100 ml

Cinta adhesiva

Tubos eppendorf para microcentrifuga de 1.5

Puntas para micropipetas estériles

Guantes

Reactivos y soluciones

Agarosa

Agua destilada

Solución TAE 1X (Buffer de electroforesis)

Bromuro de etidio (10 mg/ml)

Marcador de peso molecular (1000 pb)

Tris-Base

Acido acético glacial

EDTA 0.5 M (pH 8.0)

Colorante de carga 6X Naranja G o azul de bromofenol

Equipo

Fuente de alimentación.

Microcentrífuga

Microondas

Balanza

Transiluminador

Cámara de electroforesis horizontal

Material biológico

Plasmido pK de E. coli,

METODOLOGÍA

Preparación del gel de agarosa al 1 % y preparación de la muestra

Preparar el recipiente para el gel limpiando con etanol una cama de electroforesis y sellándola por los lados con cinta adhesiva.

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