Aislamiento del DNA

Aislamiento del DNA de origen vegetal y su caracterización espectrofotométrica. Hidrolisis de RNA y DNA e identificación de bases púricas y pirimidinas por cromatografía en capa fina.

García Santiago Diana - Maturano Téllez Ana Florencia

4QV1  Sección 1

Introducción. El DNA celular es el que tiene la información genética que asegura que los organismos o las células puedan duplicarse dando lugar a otros iguales. La función principal del DNA es el almacenamiento de la información genética completa, la biosíntesis ordenada de los tejidos y las células y definir la individualidad de un organismo dado.

El RNA es el resultado de la transcripción del DNA genómico que sirve como molde; químicamente la estructura del RNA y DNA es la misma, ya que ambas contienen cuatro tipos de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster que van en dirección 3’ a 5’. Sin embargo, hay dos diferencias principales entre el DNA y el RNA: El azúcar que está constituido en el DNA es la desoxirribosa, en tanto que el RNA contiene ribosa, que a su vez contiene un grupo hidroxilo adicional; el RNA no contiene la base nucleotídica Timina, en su lugar contiene Uracilo.

Objetivos: Aislar, purificar y caracterizar DNA de chícharo

Análisis de la técnica.

Aislamiento de DNA de chícharo. Se colocaron 15g de chícharo en un mortero, se le adicionó 5 mL de Tris/EDTA/NaCl en la cual el Tris es un regulador de pH ocupado para la lisis celular manteniendo el pH estable, mientras el EDTA se unió a cationes como el Ca 2+ para la desestabilización de la membrana celular y con el NaCl se consiguió el estallido de los núcleos de las células para la obtención de las fibras de cromatina. Después se adicionó amilasa con el fin de purificar el DNA de polisacáridos, se mezcló e incubó a temperatura ambiente. Se le adicionó una solución saturada de NaCl y 5mL de SDS 10% el cual es un detergente que separó las proteínas del DNA. Posteriormente se filtró y recupero en un tubo falcón, se adicionó cloroformo: alcohol isoamílico como disolventes. Se centrifugó a 4000 rpm para separar el DNA (sobrenadante) de material fibroso y proteínas. Finalmente, al sobrenadante se le adicionó alcohol 96°frío para la precipitación del DNA, este último haciéndose visible como una sustancia filiforme. Posteriormente se trató de recuperar el DNA, intentando no manipularlo demasiado. Esto es con el fin de evitar romper el DNA y liberar las bases nitrogenadas al medio, reduciendo así la concentración de DNA puro obtenido. Posteriormente a esto se introdujo el DNA extraído en un tupo con una solución de citrato salina diluida, la cual empleamos para lavar el DNA debido a que es una manera de eliminar impurezas. Al final, se midió el espectro de absorción del DNA, el cual es necesario para hacer los cálculos correspondientes en el apartado de resultados.

Resultados.

Cálculos.

A260/A280 => 0.643/0.413= 1.5569

2.00---------100%

1.5569------X        X= 77.845%

Concentración de DNA

C = A260/22500 * factor de dilución

C =0.643/22500 * 100

C = 0.002857

Discusión de resultados.

El espectro de absorbencia UV del DNA puro tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm correspondiente a los ácidos nucleicos y una baja a 230nm la cual corresponde al enlace peptídico, en la gráfica obtenida el comportamiento es diferente ya que la absorbancia obtenida en 230nm fue de 1.148 un valor de 0.106 correspondiente a 260nm lo que indica la presencia de proteínas en el DNA de chícharo. Para el cálculo de la concentración se utilizaron tres métodos, el primero se basó en el uso del nomograma siendo un método no muy exacto ya que depende del trazo que se realizó y la escala del nomograma, pero es un método eficiente si se necesita un resultado rápido o un indicio de cómo se va trabajando, con este método se obtuvo la mayor concentración que fue de 0.2 mg/ml. El método dos es el resultado de muchas pruebas de concentración de DNA siendo el más exacto de los tres, aunque no tan rápido como el primero, con este método se obtuvo la concentración más baja que fue 0.002857 mg/ml. El método tres es una relación en cuanto a la absorbencia de DNA puro con la absorbancia obtenida experimentalmente, tomando en cuenta que el DNA obtenido no fue 100% puro el resultado de esta relación puede no ser el valor real. Finalmente, el resultado del método dos se considera el más factible para la concentración de DNA de chícharo obtenido experimentalmente.

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