Antibiograma, método de Kirby Bauer

Antibiograma:
        Ya sabemos que el antibiograma sirve para determinar la resistencia de un microorganismo frente a un antibiótico.

Ahora les explicaré el fundamento del método de Kirby Bauer:

1. Primero necesitamos inocular una caja de Petri con un medio adecuado un microorganismo, en este caso lo están haciendo con E. coli. Podemos observar que la inoculación se realiza por toda la superficie de la placa cambiando la dirección de siembra.  
2. Posteriormente depositamos un disco de papel secante (este es un tipo de papel que absorbe el exceso de sustancias líquidas en una superficie), este papel estará impregnado del antibiótico que queremos estudiar. Observamos como esterilizan las pinzas en la flama para proceder a tomar el disco de papel.
3. Tan pronto como ponemos el disco sobre la superficie húmeda de la placa, este papel secante absorberá el agua mientras el antibiótico difundirá al agar.
4. El antibiótico difundirá de manera radial, significa que se expande en forma circular, a través del espesor del agar formándose un gradiente de concentración. Esto quiere decir que habrá más concentración del antibiótico cerca del disco de papel que en los límites hasta donde alcanzó a difundir.
5. Dejamos transcurrir de 18-24 horas de incubación para que los discos aparezcan rodeados de una zona de inhibición; esta zona refleja el detenimiento del crecimiento de las bacterias que se encuentran expuestas a las concentraciones más altas del antibiótico.

1. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias inhibidas y bacterias en crecimiento se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria, quiere decir que es la concentración mínima de antibiótico que se necesita para inhibir el crecimiento de las bacterias. Para saber qué bacterias fueron inhibidas, basta con observar que próximo al disco de papel NO hay colonias, en este caso representé la zona de inhibición con una tenue línea roja.
2. Sin embargo, este método no nos permite conocer directamente la concentración necesaria de antibiótico para llevar a cabo la inhibición del crecimiento de las colonias, por lo que para cuantificar el antibiótico que lleva a cabo la inhibición, es necesario comparar este método de disco placa con otros métodos de determinación de sensibilidad a los antibióticos. Uno de estos es el método de dilución que será explicado posteriormente.

Esta comparación se debe realizar con cientos de bacterias para minimizar los errores de cuantificación del antibiótico.

Para cuantificar, debemos hacer lo siguiente:

1. Primero se mide el diámetro de la zona de inhibición obtenida por cada una de las diferentes cepas y se grafica esta medida frente a la concentración mínima inhibitoria, obteniendo así la “recta de concordancia” que con los diámetros de inhibición nos proporciona la cuantificación de la concentración mínima inhibitoria, obviamente esta recta es el resultado de la comparación de resistencia con varios métodos.

Por lo tanto, existen unos diámetros de inhibición expresados en mm que son estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición, se deben interpretar como Sensible (S) intermedia (I) o resistente (R) según las categorías establecidas por el Comité Nacional de Estándares de Laboratorios Clínicos.

Ahora conoceremos las especificaciones:
Materiales:

• Se recomienda la utilización del agar Mueller-Hinton, pues puede ser suplementado con Magnesio y Calcio para alcanzar concentraciones fisiológicas.
• Discos de antibióticos que deben guardar a 4 grados centígrados y dejarlos reposar a temperatura ambiente antes de ser utilizados. Si los discos son beta-lactámicos deben ser congelados y utilizados después de una semana.

Método:

• Para dispensar los discos se deben hacer con pinzas estériles.
• Debemos asegurarnos que los discos contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben ser presionados ligeramente.
• No deben ser situados a menos de 15 mm del borde de la placa.
• Para placas de 150 mm no se deben emplear más de 12 discos y para las de 100 mm no más de 6 discos, así evitaremos la superposición de los halos de inhibición.
• Incubar las placas de manera invertida para que el disco pueda absorber el exceso de agua del agar, a 35 grados centígrados en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos.
• Incubar de 16 a 18 HORAS; este un periodo muy corto de incubación que nos permite el agar Mueller-hinton.

Resultados:

• Debemos saber que, cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puede tratarse de mutantes resistentes, contaminaciones o cultivos mixtos y se debe repetir el ensayo.
• Como regla general, no deben considerarse aquellas colonias diminutas que aparezcan en el halo de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa.

Resultados:

Ya sabemos que se han fijado 3 categorías, sensible, intermedio y resistente.

Sensible: Indica         que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado la concentración mínima inhibitoria puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano. Por regla general, un diámetro de inhibición de 30 a 35 mm es indicativo de una cepa altamente sensible.

Intermedio: Indica que la concentración mínima inhibitoria se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual.

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