Análisis de la enzima Invertasa de Levadura
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“ Análisis de la enzima Invertasa de Levadura ”,
Departamento de Bioquímica nutricional.
Carrera: Nutrición y Dietética , Universidad de Talca, Jueves 05 de junio de 2014
Profesores de Laboratorio: Fernando Poblete, Felipe Ávila
Integrantes: María Gabriela Díaz Díaz, Nayadeth Escalona Fuentes
I. Resumen
Fundamento:
Objetivo: La extracción de la invertasa de levadura y, posteriormente, la verificación de su acción sobre una solución de sacarosa, será la finalidad del laboratorio . La misma se comprobará mediante el test de Fehling, el cual permite detectar la presencia de los productos de la hidrólisis de este disacárido (glucosa y fructosa).
Materiales y procedimiento: Resultados: Conclusiones:
Palabras clave:
II. Introducción:
Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos.
Los enzimas son catalizadores por lo que aumentan notablemente la velocidad de las reacciones. Así, en condiciones fisiológicas hay un sinnúmero de reacciones que sin la presencia de un catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
Una enzima muy importante en la industria alimentaria es la Invertasa de levadura.
La Invertasa, conocida también como β–fructofuranidasa es una enzima que cataliza la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa (1)
La Invertasa se puede conseguir de células de levadura que se rompen por auto-lisis, centrifugando y tomando el sobrenadante.
El uso frecuente de la Invertasa en alimentos azucarados se basa en la transformación lenta y parcial de la sacarosa en azúcar invertido que tiene mayor poder edulcorante, mayor carácter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto, menor tendencia a cristalizar y endurecer.
A diferencia de otras enzimas, la Invertasa presenta una activada elevada en un rango amplio de pH (desde 3,5 a 5,5) actuando óptimamente dentro de un pH de 4,5. En relación a la temperatura óptima en la que cataliza la reacción de sacarosa es de alrededor de 55°C.
Cabe decir que uno de los inhibidores de la enzima es la presencia de metales pesados tales como Ag1+, como también la presencia de sulfato de cobre.
Un reactivo que es muy útil para evaluar si es que ha ocurrido la reacción de catálisis de sacarosa por parte de la enzima Invertasa es a través del reactivo de Fehling.
Este ensayo sirve para demostrar la presencia de glucosa, así como para detectar derivados de ésta tales como la sacarosa o la fructosa (2)
El ensayo se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de los aldehídos.
Éste se oxida a ácido y reduce la sal de cobre en medio alcalino a óxido de cobre, formando un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el reactivo de Fehling a óxido de cobre rojo, se dice que es un azúcar reductor.
Esta reacción se produce en medio alcalino fuerte, por lo que algunos compuestos no reductores como la fructosa que contiene un grupo cetona, puede enolizarse a la forma aldehído dando lugar a un falso positivo. Al reaccionar con monosacáridos se torna verdoso, y si lo hace con disacáridos toma el color del ladrillo.
A partir de lo anterior el objetivo de este informe es demostrar la capacidad de catálisis de la enzima Invertasa de levadura en distintas muestras de azúcares mediante la aplicación del reactivo de Fehling en cada uno de ellos.
III. Materiales:
Procedimiento:
IV. Resultados:
V. Discusión y conclusión:
La enzima Invertasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa a glucosa y fructosa, frecuentemente a esta reacción se denomina “inversión”.
En este trabajo experimental, el uso del reactivo de Fehling el cual es una disolución que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores, sirve para reconocer la presencia de glucosa o fructosa, por lo que podemos decir fue bastante útil como prueba colorimétrica para verificar si es que la reacción de la enzima ocurrió en cada uno de los tubos de ensayo.
Con respecto al primer tubo el resultado de la coloración del reactivo de Fehling fue negativo, ocasionado porque no se le aplicó a la sacarosa que se encontraba dentro del tubo la muestra de enzima, por lo que no ocurrió catálisis de sacarosa.
En los tubos 2 y 3 se observó un cambio por la tinción de ambos tubos a un color rojo ladrillo, esto nos muestra que al presentarse la enzima Invertasa, se produce la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa. Debido a que este ensayo sirve para demostrar la presencia de glucosa, así como para detectar derivados de ésta tales como la sacarosa o la fructosa se entiende la respuesta positiva que arrojo la aplicación del reactivo en ambos tubos.
En el tubo 4 la reacción no arrojo positivo. Esto se debe a que la enzima que se aplicó en este tubo se encontraba a una temperatura que no era la óptima (55° C) en la que acontece la catálisis de la sacarosa, por lo que no se formaron los productos glucosa + fructosa los cuales debió reconocer el reactivo de Fehling.
En el quinto y sexto tubo de ensayo también se observó una respuesta negativa por parte del ensayo de Fehling y esto es causado por la presencia de NaOH en ambos tubos. La enzima Invertasa como toda proteína, soporta cierto rango pH, fuera del cual se desnaturaliza, es si ocurre esto la enzima pierde su estructura, la cual le confiere su función particular, y por este motivo no se generó la hidrolisis del disacárido sacarosa.
En el tubo 7 y 8 se determinó que también la prueba del reactivo de Fehling da negativo, explicándose porque el sulfato de cobre tiene un efecto inhibidor en elevadas concentración.
El tubo numero 9 dio una tinción de color azul, por lo que nos mostró nuevamente que sin la presencia de la enzima, difícilmente ocurrirá una hidrolisis, en este caso, de sucralosa.
El tubo 10 a pesar de que no contenía sacarosa, la cual es necesaria para que actúa la enzima Invertasa, si dio el color rojo ladrillo que demuestra que el contenido de la muestra fue catalizada. Esto lo explicamos porque dentro de este tubo agregamos sucralosa, la cual se fabrica por Halogenación selectiva de sacarosa, la única diferencia en comparación con su precursor sacarosa, es la presencia de enlaces de cloro en la estructura de sucralosa, formándose a lo menos como posible producto una glucosa, que es reconocida por la prueba de Fehling.
Obviamente los tubos 11 y 12 no arrojaron positivo sencillamente porque ambos contenían almidón y la Invertasa es una enzima que cataliza la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa.
La importancia que recae conocer esta enzima es que se emplea tanto en la industria farmacéutica como en la alimentaria.
El uso frecuente de la Invertasa en alimentos azucarados se basa en la transformación lenta y parcial de la sacarosa en azúcar invertido que tiene mayor poder edulcorante, mayor carácter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto, menor tendencia a cristalizar y endurecer.
De esta manera, actúa como un agente de reblandecimiento en alimentos azucarados con tendencia a cristalizar la sacarosa y evaporar agua, lo que afecta su aspecto y consistencia Además, la fructosa resultante tiene cierto carácter humectante y da sensación de frescura al producto. Productos de confitería, como bombones con relleno, productos de jaleas, fondants, mazapanes y pasteles adquieren entonces una consistencia suave, cremosa y blanda, aún después de un almacenamiento prolongado (3), lo cual sin duda es un conocimiento útil tanto para la ciencia de la industria alimentaria y en especial a nuestra carrera.
Bibliografía:
Ávila, Felipe; Poblete, Fernando. MANUAL PRÁCTICAS DE LABORATORIO BIOQÍMICA NUTRICIONAL. Edición 1, Universidad de Talca Chile, 2014.
(1) http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2011_1/Veana_Invertasa.pdf Invertasa del genero aspergillus y su impacto biotecnológico, 15 de junio de 2014, 19:56 hrs.
(2) http://blog.uchceu.es/eponimos-cientificos/reactivo-de-fehling/ reactivo de Fehling, 20 de junio de 2014, 13:23 hrs.
(3) http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/02.html enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados, 21 de junio de 2014, 20:46 hrs.
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