CULTIVO Y ANTIBIOGRAMA

CULTIVO Y ANTIBIOGRAMA

RESULTADOS DE APRENDIZAJE: Conocer los medios de cultivo y su composición, saber cuándo pedir e interpretar las pruebas de susceptibilidad a los antibacterianos

MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS:

• Fomentar el conocimiento y uso de los medios de cultivo bacterianos.

• Incentivar la correlación del crecimiento y metabolismo bacteriano con la fisiopatología de la enfermedad.

• Crear cultura de diagnóstico en base a la identificación de género y especie causantes de una patología infecciosa.

INTRODUCCIÓN:

El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismo mediante la toma de bacterias de un sitio de infección por métodos de recolección de muestra y crecimiento en un medio artificial en el laboratorio.

Las bacterias tienen necesidades nutricionales que incluyen diferentes gases, agua, electrolitos, nitrógeno, fuentes de carbono, proteínas, pH, colorantes, humedad.

Si un medio de cultivo cubre los requerimientos de una célula bacteriana, ésta se multiplicará en cantidades suficientes para permitir la visualización a simple vista.

Los medios de crecimiento son utilizados en dos fases: líquida (caldo) o sólida (agar) Fig. 1. En los medios líquidos los nutrientes se disuelven en agua y el crecimiento bacteriano se manifiesta con un cambio en el aspecto del caldo, de límpido a turbio, se requiere por lo menos de 106 bacterias para que la turbidez se observe a simple vista.

Los medios sólidos se elaboran agregando un agente solidificante a los nutrientes y al agua. La agarosa es el agente solidificante más común. El agar contenido en la placa de Petri se denomina agar placa.

En las condiciones de incubación adecuadas, cada bacteria inoculada proliferará lo suficiente para ser observada a simple vista y se le conoce como colonia. Todas las células bacterianas dentro de una colonia son del mismo género y especie, lo que otorga características genéticas y fenotípicas idénticas, es decir un clon. Los cultivos bacterianos derivados de una sola colonia o clon se denominan puros.

Fig. 1 Medios de cultivo

Sólidos Semi sólidos Líquidos

CLASIFICACIÓN Y FUNCIONES DE LOS MEDIOS

Los medios se clasifican de acuerdo a su función y uso: enriquecimiento, apoyo, selectivo y diferencial.

• Medios de enriquecimiento: contienen nutriente específicos requeridos para el desarrollo de determinados patógenos que pueden estar presentes solos o con otras especies bacterianas en una muestra del paciente. Este tipo de medios se utiliza para favorecer el desarrollo de un determinado patógeno.

• Medios de apoyo: contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales.

• Medios selectivos: Contienen uno o más agentes que inhiben todos los microorganismos excepto los que son buscados. Los agente inhibidores utilizados para este propósito son colorantes, ácidos biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos.

• Medios diferenciales: emplean factores que permiten que las colonias de una especie exhiban ciertas características metabólicas o de cultivos que puedan utilizarse para diferenciarles de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.

Principales medios de cultivo utilizados

Infusión cerebro corazón BHI Agar chocolate

Columbia CNA con sangre Agar Hektoen entérico

Agar MacConkey Agar sangre de cordero

Aga Thayer Martin Caldo tioglicolato

Agar bilis esculina Agar con triosulfato y sales biliares TCBS

Agar eosina azul de metileno EMB Agar Salmonella – Shigella

REQUERIMIENTOS AMBIENTALES:

Los factores ambientales más importantes son la disponibilidad de oxígeno, dióxido de carbono, temperatura, pH, humedad del medio y atmósfera.

1. Disponibilidad de oxígeno y dióxido de carbono: Las bacterias pueden ser aerobias, usan el oxígeno como un aceptor de electrones y se desarrollan bien en el ambiente. La mayoría de bacterias de interés clínico son anaerobios facultativos, capaces de crecer en presencia (aerobios) o ausencia (anaerobiosis) de oxígeno. Otras bacterias aerobias requieren niveles bajos de oxígeno y se denominan micro aerófilas. Las bacterias anaerobias son incapaces de utilizar oxígeno. La disponibilidad de CO2 es importante para el desarrollo de ciertas bacterias, así las que se desarrollan con concentraciones elevadas de CO2 de 5 – 10% se denominan capnófilos.

2. Temperatura: Los patógenos bacterianos se desarrollan a temperaturas similares a la de los tejidos y órganos internos de los humanos, por lo tanto las estufas de incubación se colocan entre 35 – 37º C, pudiendo existir variantes con mayor o menor temperatura.

3. pH: Los patógenos clínicos prefieren un rango de 6,5 a 7,5.

4. Humedad: La pérdida de agua de los medios puede ser perjudicial para el crecimiento bacteriano ya que existe una menor cantidad de agua disponible para las reacciones metabólicas o un aumento relativo de la concentración de soluto en los medios, lo que puede provocar un shock osmótico de la bacteria y causar su lisis.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE MUESTRA:

Para favorecer el crecimiento, aislamiento y selección de los agentes etiológicos, los inóculos de la muestra se siembran sobre la superficie de las placas respetando un patrón estándar, de modo que se obtengan colonias separadas y pueda realizarse un análisis semicuantitativo.

La evaluación inicial de la morfología de la colonia proporciona a los médicos información preliminar con respecto a los resultados del cultivo del paciente.

Las características de la colonia nos permite la identificación bacteriana al igual que el éxito o fracaso de los procedimientos posteriores de identificación.

Los criterios utilizados para caracterizar el crecimiento bacteriano son: tamaño de la colonia, pigmentación, forma de la colonia (forma, elevación y bordes de la colonia), aspecto de la forma de la colonia (brillante, opaca, roma, transparente), olor, color (como resultado de crecimiento bacteriano, hemólisis, cambios en el color de los indicadores de pH) Fig. 2.

ANTIBIOGRAMA

Objetivos:

• Explicar cómo cada grupo de agentes antimicrobianos actúa sobre estructuras clave o rutas metabólicas en las bacterias

• Identificar los mecanismos de resistencia en las bacterias.

• Describir como las bacterias adquieren resistencia a los agentes antimicrobianos.

ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

PAREDED CELULAR:

Membrana externa: es la principal barrera de permeabilidad y ayuda a retener proteínas en el espacio periplásmico.

Porinas: son canales lentos, de agua en la membrana externa que facilita el transporte de nutrientes y sustancias de bajo peso molecular dentro de la célula incluyendo agente antimicrobianos.

Lipopolisacáridos: se encuentran en la superficie de la célula y son el componente esencial de las endotoxinas, las mismas que causan enfermedad y dan a las bacterias gram negativas su carga negativa.

Lipoproteínas: adhieren la membrana externa a la capa de mureína.

Capa de peptidoglucano: es un polímero relativamente delgado de ácido N- acetilmurámico y N- acetil glucosamina entrelazados y se conoce como la capa de mureína o pared celular y es la responsable de mantener la forma del microorganismo. Está localizado dentro del espacio periplásmico.

Espacio periplásmico: Se encuentra entre la membrana externa y la membrana citoplasmática. Las proteínas periplásmicas incluyen proteínas de enlace para sustratos específicos, enzimas hidrolíticas y enzimas detoxificantes.

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA:

Rodea al citoplasma y contiene proteínas y fosfolípidos. Muchas de las proteínas contenidas en al membrana celular son enzimas responsables del metabolismo celular, además sirve como una barrera de permeabilidad y un enlace de permeabilidad para las sustancias que entran en la célula

CITOPLASMA Y OTROS COMPONENTES INTERNOS:

Contiene los cromosomas, ribosomas y otras estructuras internas. La mayoría de bacterias tienen un solo cromosoma a excepción del Vibrio cholerae, que tiene dos cromosomas.

ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS

PARED CELULAR: Contiene sólo dos componentes principales es menos compleja que la pared de las Gram negativas.

Ácidos teicoicos: son polímeros que están entrelazados en la capa de péptidoglicano y se extiende en forma de cilios más allá de la superficie de las células gram positivas, estas son antígenos de superficie en aquellos organismos que la poseen.

Peptidoglicano o capa de mureína es mucho más gruesa que la de las bacterias gram negativas, es responsable de mantener la forma del organismo y por lo general se conoce como pared celular.

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA, CITOPLASMA Y OTROS COMPONENTES INTERNOS:

Son estructuras similares a las bacterias Gram negativas.

AGENTES ANTIMICROBIANOS

AGENTES BACTRIOSTÁTICOS VS. BACTERICIDAS

Los agentes bacteriostáticos como las tetraciclinas inhiben el crecimiento y multiplicación de las bacterias. A partir de la exposición a un agente bacteriostático, las bacterias en una población susceptible cesan su división. Si el agente es retirado, las células vuelven a multiplicarse.

Los agentes bactericidas, como las fluoroquinolonas, no sólo inhiben el crecimiento bactriano sino también desencadenan mecanismos dentro de la célula que conducen a la muerte celular. Las acciones de los agentes bactericidas son irreversibles por tanto causan la muerte.

MODOS DE ACCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS:

1. INTERFERENCIA CON LA SÍNTESIS DE LA PARED CELULAR: Bloquean la síntesis de la pared bacteriana principalmente el péptido glucano y por tanto son activos contra bacterias en crecimiento, son Bactericidas.

2. ACTIVIAD DE LOS BETA LACTÁMICOS EN LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS: los betalactámicos entran a la célula a través de los canales porínicos de la membrana externa. En las células susceptibles, las moléculas betalactámicas se unen a las proteínas de unión de penicilina (PBPs) que son enzimas necesarias para la síntesis de la pared celular. La unión entre las moléculas betalactámicas a las PBPs ubicadas en la superficie de la membrana citoplasmática bloquea su función y produce paredes debilitadas o defectuosas que conduce a la lisis y muerte celular.

3. ACTIVIDAD DE LOS BETALACTÁMICOS EN LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS: Los antimicrobianos betas lactamicos se difunden a través de la pared celular. Los siguientes pasos son similares a aquellos para las bacterias Gram negativas. Las moléculas betalactámicas se une a las PBPs, formando paredes debilitadas y lisis celular.

4. INTERFERENCIA CON LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA: Las moléculas se difunden a través de la membrana externa y pared celular hacia la membrana citoplasmática. Estas se unen a la membrana citoplasmática alterándola y desestabilizándola, esto causa el derrame del citoplasma hacia el exterior de la célula provocando la muerte. Los agentes antimicrobianos que interfieren con la membrana citoplasmática son bactericidas.

5. INTERFERENCIA CON LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE EL ENLACE A LA SUB UNIDAD RIBOSOMICA 30S: Las tetraciclinas se unen a la subunidad 30 S del ribosoma y bloquean la adherencia del RNA de transferencia, puesto que no pueden agregar más aminoácidos a la cadena de proteínas que está en crecimiento, la síntesis de proteínas es inhibida. La acción es bacteriostática.

Los aminoglucósidos también se unen a la subunidad 30S y pueden bloquear la síntesis de proteínas de dos maneras diferentes: a) Se pueden adherir a la subunidad 30 S y prevenir que se una al RNA mensajero (mRNA) y b) provocar lectura errada del mRNA. Esto provoca la inserción de aminoácidos erróneos en la proteína o en la interferencia con la capacidad de los aminoácidos para conectarse unos con otros. Es un efecto bactericida.

6. INHIBICION DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA UNIÓN A LA SUBUNIDAD RIBOSOMICA 50S: Los Macrolidos y lincosáminas se adhieren a la subunidad ribosómica 50 S provocando la terminación del crecimiento de la cadena proteica y la inhibición de la síntesis de proteína, tiene una acción bacteriostática.

7. INTERFERENCIA CON LA SÍNTESIS DE ACIDO NUCLEICO: Las fluoroquinolonas interfieren con la síntesis de DNA bloqueando la enzima de DNA girasa, ésta ayuda a enrollar y desenrollar el ADN durante la replicación de ADN. La enzima se adhiere al ADN e introduce rupturas dobles en las cadenas que permiten al ADN desenrollarse. Las fluoroquinolonas se unen al complejo de DNA girasa -DNA y permiten a las cadenas de DNA rotas liberarse dentro de la célula lo que conduce a la muerte celular.

La rifampicina se une al ARN polimerasa ADN dependiente lo que bloquea la síntesis de ARN y resulta en la muerte celular.

8. INHIBICION DE LA RUTA METABOLICA DE LA SÍNTESIS DEL ÁCIDO FOLÍCO CAUSADAS POR SULFAIDAS Y TRIMETOPRIMA: Para muchos microorganismos la síntesis del ácido para amino benzoico (PABA) es un metabolito esencial y está involucrado en la síntesis de ácido fólico, un importante precursor de la síntesis de ácidos nucleicos. Las sulfonamidas son estructuras análogas al PABA y compiten con el PABA por la enzima dihidropepteroata sintetasa. La trimetoprima actúa en la ruta de la síntesis del ácido fólico en un punto posterior al de las sulfonamidas inhibiendo la enzima dihidrofolato reductasa. Estos son bacteriostáticos.

RESISTENCIA BACTERIANA

Se denomina resistencia clínica de una bacteria a un antimicrobiano cuando éste es incapaz de curar una infección causada por dicha bacteria. Existen especies de bacterias que siempre son resistentes a un tipo de antimicrobianos. En este caso hablamos de resistencia natural; por ejemplo todas las bacterias anaerobias son resistentes a los aminoglucósidos, Pseudomona aeruginosa son resistentes a la penicilina, etc. Otras veces, un microorganismo que originalmente era sensible a un antimicrobiano se hace resistente a él. Esta forma de resistencia se denomina adquirida y hoy día es muy frecuente como consecuencia de un uso masivo y del abuso de antimicrobianos, los microorganismos pueden desarrollar resistencias por muy diversos mecanismos por ejemplo: producción de enzimas inactivantes que destruyan el antimicrobiano como la producción de enzimas betalactamasas, la alteración de la pared bacteriana de forma que impida la penetración del antibiótico y alteraciones diana sobre los cuales actúan los antimicrobianos. La aparición de resistencia en un microorganismo puede ser consecuencia de una mutación en su DNA, en otras ocasiones, los microorganismos que se han hecho resistentes pueden transmitir esta resistencia a otros microorganismos utilizando mecanismos de transferencia de material genético son las llamadas resistencias transmisibles3

MECANISMO DE RESITENCIA ANTIMCROBIANA

• PRODUCCION DE ENZIMAS:

• Las betalactamasas son enzimas que hidrolizan los agentes antimicrobianos beta lactámicos, por tanto la célula es resistente a la acción de los medicamentos betalactámicos. En las bacterias Gram negativas los medicamentos betalactámicos entran a la célula a través de as porinas y encuentran a las betalactamasas en el espacio periplásmico. Las betalactamasas destruyen las moléculas beta lactámicas antes que éstas tengan la oportunidad de alcanzar sus PBPs blancos. En las bacterias Gram positivas son secretadas extracelularmente en el medo circundante y destruyen las moléculas betalactámicas antes que tengan la oportunidad de entrar en la célula.

• Enzimas que modifican los aminoglucósidos: Las bacterias Gram negativas producen enzimas adenilantes , foforilantes o acetilantes que modifican un aminoglucósido para inactivarlo.

• Cloranfenicol acetil transferasa bloquean al cloranfenicol

• IMPERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA BACTERIANA EXTERNA: Alteración de las porinas en las bacterias Gram negativas evita la unión entre los betalactamicos con las PBPs específicas convirtiéndole en resistente al antibiótico.

• ALTERACIÓN DE LOS BLANCOS: Las PBPs son alteradas mediante mutación de manera que los betalcatamicos no puedan unirse a ellas y por tanto la bacteria es resistente.

• METILACIÓN DEL ARN ribosómico confiere resistencia a los macrólidos.

• MUTACIONES EN LOS GENES DE ADN GIRASA Y TOPISOMERASA IV confieren resistencia a las quinolonas.

• BOMBAS DE EFLUJO: El eflujo activo de antibióticos es mediado por proteínas transmembrana, las mismas que forman canales que exportan activamente a un agente antimicrobiano fuera de la célula tan rápido como entran.

• ALTERACIÓN DE LAS RUTAS METABÓLICAS: Mutaciones que inhiben la timidilato sintetasa que bloquean la conversión de deoxiuridilato a timidilato. Estos mutantes requieren tilian o timidina exógena para la síntesis de ADN y por ende son resistentes a los antagonistas de la ruta del folato como las fulfonamidas y trimetoprima Fig. 3.

INTRODUCCIÓN A LAS PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS

En las últimas décadas, el pronóstico de las infecciones ha mejorado como consecuencia, principalmente, del desarrollo de la quimioterapia. La quimioterapia puede definirse como el tratamiento con sustancias químicas antimicrobianas por vía general o sistémica dirigida a destruir o impedir el crecimiento de microorganismos causantes de la infección. Los quimioterápicos, antibióticos o anti infecciosos son sustancias de toxicidad selectiva, y sobre ello deben actuar sobre dianas diferentes a las que tienen las células humanas. De esta manera deben ser mucho más tóxicos para el microorganismo o parásito causante de la infección que para el huésped. Los quimioterápicos, antibióticos o anti infecciosos son habitualmente poco tóxicos, por lo que se pueden utilizar por vía sistémica (oral o parenteral). Sin embargo al tener mayor toxicidad, el uso de antisépticos y desinfectantes se limita a la piel, instrumental y superficies1.

La quimioterapia científica comienza en 1909 con Paul Ehrlich y el tratamiento de la sífilis con sales de arsénico. Este científico alemán podía desarrollar en aquellos años un proyectil mágico capaz de matar al agente infeccioso sin causar daño al enfermo.

Cada antimicrobiano posee un espectro de acción que es el conjunto de microorganismos sobre los que es activo. Antimicrobianos de amplio espectro son los activos frente a un grupo amplio de microorganismos y antimicrobianos de corto espectro, los activos frente a un grupo limitado de microorganismos.

Los antimicrobianos pueden clasificarse, en función del efecto que causan en las bacterias, como bactericidas o bacteriostáticos. Bactericidas son aquellos capaces de destruir a las bacterias, y bacteriostáticos aquellos que solo detienen su crecimiento mientras el antimicrobianos esté presente, pero que no matan al microorganismo. Cuando una infección se trata con antimicrobianos bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento microbiano pero que nos destruyen las bacterias, serán los mecanismos de defensa del huésped los que terminen de eliminar los microorganismos causantes de la infección. Por eso, cuando un paciente con alteración de defensas (inmunodeprimidos) adquiere una infección será necesario el uso de antimicrobianos bactericidas3.

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)

Se denomina concentración mínima inhibitoria (CMI) en microbiología, es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación. La concentración mínima inhibitoria es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.[1]

Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser determinadas mediante métodos de micro dilución en caldo, normalmente siguiendo las directrices de centros de referencia tales como el CLSI (Clinical Laboratory Institute Standards), BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy) o EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Existen otros métodos basados en la difusión en agar, tales como difusión de discos, y tiras de Etest. Las tiras de Etest son un método cuantitativo de difusión en agar comercializado por AB Biodisk, Solna, Sweden. Consiste en unas tiras de plástico inerte que incorporan un gradiente de concentración de antimicrobiano. Cuando se depositan sobre las placas de agar inoculadas, el antimicrobiano difunde en el medio, y tras la incubación, se determina la CMI en el punto de intersección de la elipse de inhibición del crecimiento.[1]. [2]

En medicina, la concentración mínima inhibitoria no sólo se usa para determinar la concentración de antimicrobiano que recibirá el paciente sino también el tipo de antimicrobianos a utilizar, lo que a su vez reduce la oportunidad de resistencia microbiana a agentes antimicrobianos específicos.

Se denomina concentración mínima bactericida (CBI) de un microorganismo a la menor concentración de antimicrobiano necesaria para matar a un determinado microorganismo. La concentración inhibitoria mínima y bactericida mínima se las mide en microgramos/mililitro4.

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS

Las pruebas de susceptibilidad a los antibacterianos es el estudio en el laboratorio de la actividad de diversos antibióticos frente a una bacteria. Con su uso se determina frente a qué antimicrobianos las bacterias son sensibles o resistentes. Así, frente a una infección determinada en la que hayamos aislado el microorganismo causal, podremos determinar qué antimicrobianos serán eficaces para tratar la infección. Además estas pruebas se utilizan para determinar el fenotipo de las diferentes bacterias y hacer un seguimiento epidemiológico y comportamiento de la resistencia. Existen dos métodos principales difusión con discos y dilución. Actualmente se dispone de un sistema basado en el método de dilución que permite la determinación de las CMI en la mayoría de los antimicrobianos de una manera sencilla. La utilización de antimicrobianos basada en los resultados del antibiograma del microorganismo causal se denomina terapéutica específica. La utilización empírica de antimicrobianos debe limitarse lo más posible y requiere un profundo conocimiento de las características y espectro de cada uno de ellos, de la epidemiología de las resistencias a los antimicrobianos en el área y una orientación clínica adecuada3.

MÉTODO DE BAUER – KIRBY

El método Kirby-Bauer, uno de los más empleados, consiste en situar sobre una placa de cultivo inoculada en césped (es decir, que en ausencia de agentes selectivos crecería en toda la superficie de una placa de Petri) un número de discos de celulosa impregnados con distintos antibióticos; tras la incubación del dispositivo, la bacteria no crecerá en torno a los discos impregnados del antibiótico al que es sensible. Además, el diámetro del halo de inhibición está relacionado con la efectividad del antibiótico para esa cepa 2.

Figura 4. Método de Bauer Kerry

MÉTODO DE LA ELIPSOMETRÍA

Es la combinación de las dos anteriores donde utilizando en vez de discos tiras con antimicrobianos en concentraciones crecientes y cuyo halo de sensibilidad es en forma de elipse (figura 5)

MÉTODO DE LA DIFUSIÓN RADIAL (Método de Bauer – Kirby)

REACTIVOS Y MATERIALES

• Discos de papel filtro impregnados del antibacteriano, en dosis conocidas, de concentración alta y media, marcados con las iníciales del antibacteriano1.

• Medio de cultivo que contiene una bacteria aislada en estado puro

• Medio de cultivo MULLER HINTON, para la inoculación de la bacteria de prueba y con espesor de 4mm. Sobre este medio se depositan los discos de susceptibilidad.

• Pinza de punta fina estéril.

• Hisopo estéril para la inoculación de la especie pura.

• Mechero de Bunsen.

PROCEDIMIENTOS PARA CULTIVO PURO

Hay dos procedimientos: Directo e Indirecto

1. PROCEDIMIENTO DIRECTO

Generalmente se utiliza una muestra de una secreción tomada en condiciones asépticas (revisar práctica # 2) colocándola sobre la placa de crecimiento bacteriano se puede aplicar directamente los discos, según el germen Gram positivo o negativo desarrollado.

2. PROCEDIMIENTO INDIRECTO POR CULTIVO PURO

Para este procedimiento es necesario utilizar un cultivo puro que tenga el equivalente de un patrón o estándar de turbidez igual al de MAC FARLAND N°0.5, el cual indica una concentración bacteriana de (1-2 X 108 ufc/ml) por milímetro cúbico.

Metodología- Antes de colocar los discos la superficie de la placa se siembra con un hisopo que se ha sumergido en una suspensión bacteriana estandarizada, de turbidez igual al estándar 0.5 de turbidez de McFarland. La superficie de la placa se barre en tres direcciones según las manecillas del reloj girando 300 para asegurar una distribución igual y completa del inoculo sobre la placa. Dentro de los 15 min posteriores a la siembra se aplican los discos de papel impregnados de antibacterianos en dosis conocidas y selectivas se colocan en un medio puro, si la bacteria es susceptible provocará un halo transparente de inhibición lo que indica que el fármaco es eficaz para tratar dicha bacteria, si no aparece el halo, es resistencia total al fármaco.

Figura 6. Método de Bauer Kirby

PROCESO DE SELECCIÓN Y COLOCACIÓN DE DISCOS

La selección de los discos a utilizar no solo depende del tipo y grupo bacteriano, sino de la localización de la infección y hasta de la edad del paciente, es decir, depende de la realización de una buena historia clínica y de un examen físico detallado.

En la siguiente tabla describimos algunos bacterianos con espectro probado en bacterias Gram + y Gram –

PARA GRAM POSITIVOS PARA GRAM NEGATIVOS

Oxacilina

Penicilina

Vancomicina

Eritromicina

Clindamicina

Tetraciclina

Ciprofloxacina

Gentamicina

Trimetropin Sulfa

Rifampicina

Linezolid Amoxicilina/clavulánico

Amoxicilina

Cefalosporina de 1ra generación

Cefalosporina de 2da generación

Cefalosporina de 3ra generación

Gentamicina

Amikacina

Cloranfenicol

Tetraciclina

Ciprofloxacina

Trimetropin Sulfa

Imipenem (Pseudomona)

Aztreonam (Pseudomona

Para gram negativos ej. enterobacteriaceas el disco de ampicilina/sulbactam o amoxicilina/ácido clavulánico debería ir siempre en el centro del agar para evidenciar la presencia del fenotipo de betalactamasas (enzima que destruye el anillo beta lactámico de las penicilina impidiendo su acción eficaz) con las cefalosporinas de 2da y 3ra generación.

En bacterias gran positivas como estafilococos el disco de eritromicina siempre se coloco a 15mm del disco de clindamicina para evidencia la producción de metilazas constitutivas e inducibles

Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (Susceptibilidad “S”, Inhibición “I”, Resistencia”R”) obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que no es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina).

Para la colocación de los discos se debe:

• Secar los discos de susceptibilidad junto al mechero de Bunsen, valiéndose de una pinza estéril de puntas finas y depositar cada disco sobre la superficie del MULLER HINTON, presionándolo un poco para evitar su deslizamiento, debe dejarse de 10 a 20mm ideal 15mm de espacio entre cada disco de borde a borde.

Someter a incubación según la especie de bacteria a 37°, 35° o 42°C durante un periodo de 18-24 horas, al final del cual se procederá a realizar la lectura de los halos de susceptibilidad.

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