Cuantificacion De Lipasa

LIPASA

FUNDAMENTO

Los animales superiores rompen los triglicéridos en el intestino delgado por la acción de enzimas hidroliticas llamadas lipasas que están presentes en la sección del páncreas. Las lipasas pertenecen a la clase general de enzimas conocidas como esterasas, que catalizan la reacción general:

Las enterasas simples catalizan solo la hidrólisis de esteres de alcoholes simples. Las lipasas catalizan la hidrólisis de esteres de glicerol, pero no hidrolizan esteres simples. Los compuestos que son sustrato de las lipasas son digliceridos y triglicéridos. La hidrólisis de monogliceridos por estas enzimas es muy lenta. El triglicérido se hidroliza en las posiciones alfa o alfa' para llegar al 1,2-diglicerido que es opticamente activo. Las tasas de hidrólisis no son afectadas apreciablemente por variaciones en el nombre de átomos de (12-18) y en el número de dobles enlaces en el grupo R del ácido graso.

Las preparaciones crudas de lipasas son hechas por la extracción del polvo del páncreas con acetona.

Para la acción optima de las lipasas es necesario aumentar la concentración de sustrato efectivo. Los di y triglicéridos son prácticamente insolubles en agua y por lo tanto no están disponibles para la actividad de la enzima. La concentración efectiva de sustratos se aumenta al emulsificar con agentes como jabones, proteínas o sales biliares. Luego es necesario agregar iones de calcio para precipitar los ácidos grasos libres conforme se vayan formando en la hidrólisis. Por ultimo, la actividad de la lipasa esta marcada por el pH de la solución. La actividad optima de la lipasa se obtiene en pH entre 8 y 9. Para mantener este pH favorable se usa un buffer de hidróxido de amonio.

En transcurso de la hidrólisis, se producen protones. Estos protones se consumen por el buffer, con la formación del ion amonio y el debilitamiento de la capacidad amortiguadora. La capacidad amortiguadora se restituye durante la hidrólisis por la adición ocasional de hidróxido de amonio, manteniendo el sistema rosado de la fenoftaleina. por lo tanto la realización de la hidrólisis se refleja en el aumento del ion amonio. La concentración del ion amonio se determina por la titulación de muestras con solución estándar de hidróxido de potasio. La solución de alcohol-eter sirve para detener la lipasa y para aumentar el pK de la fenoftaleina por 2-3 unidades de pH. El pK del sistema de amortiguador no se afecta o puede disminuir. Por lo tanto la adición de alcohol-eter a la muestra de la mezcla de lipasa decolora la fenoftaleina y es posible titular el ion amonio con una base mas fuerte para el rosado usual de la fenoftaleina. (Clark 1964)

La reacción de hidrólisis de favorece con los iones de calcio que impide que los ácidos grasos se vuelvan a esterificar con el glicerol, formando una sal. Si se dejaran los ácidos grasos libres ocurriría transesterificacion.

DESARROLLO

Para la extracción de la enzima de la pancreatina se usa un buffer para que no se desnaturalice la enzima. La enzima es de tipo globular, por lo que es soluble en soluciones acuosas. El sobrenadante de la centrifugación tiene la enzima en solución. Este sobrenadante se mantiene a 0C para inactivar la enzima.

En el ensayo enzimático se agrega el aceite de oliva que va a ser la fuente de triglicéridos. Los triglicéridos son sumamente apolares, por lo que si se agregan así a la solución que tienen la enzima no ocurriría la reacción porque el sustrato no estaría disponible para que forme el complejo sustrato-enzima. Para que el sustrato este disponible para la reacción es necesario que usar la bilis artificial como emulsificante. Luego de la reacción se producen ácidos grasos libres que si no se eliminan

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