DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

1. MARCO TEÓRICO:

El método de Lowry es una técnica colorimétrica que permite calcular la concentración de proteínas totalespresentes en una disolución o extracto biológico. El método se basa en el empleo de dos reactivos. El componente fundamental del Reactivo A es el CuSO4, que aporta iones Cu2+. En medio alcalino, estos iones reaccionan con aquellas moléculas que tengan varios enlaces peptídicos consecutivos, es decir, péptidos y proteínas, dando lugar a complejos solubles que presentan un color azul pálido. El Reactivo B, también conocido como reactivo de Folin-Ciocalteau o reactivo de fenoles, reacciona con aquellos aminoácidos de la proteína que lleven en su cadena lateral grupos fenólicos (la tirosina, la fenilalanina y el triptófano), dando lugar a un color azul intenso.

La intensidad del color producido en el tubo de ensayo, que se mide con un espectrofotómetro, es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la disolución, lo que permite cuantificar ésta si se compara con tubos preparados de forma similar con cantidades conocidas de una proteína de referencia, con los que se hace una recta de calibrado.

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que mas frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie. En esta práctica nos ocuparemos únicamente del segundo de ellos. Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante varia entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina. La reacción que tiene lugar en el metodote Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+ , en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. 2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada. Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina. En la presente práctica haremos esta curva de calibración, practicando la reacción de Lowry y aprendiendo el uso del espectrofotómetro

1. Determinación de gluten en harinas de trigo

El gluten es una proteína de los cereales insoluble en agua, que se hidrata dos veces su peso de agua, está compuesto de dos fracciones, una prolamina llamada gliadina y una glutelina llamada glutenina que se separan por precipitación selectiva con etanol y ácido. Las gluteninas son las responsables de las propiedades elásticas y cohesivas de la harina de trigo en el proceso de elaboración del pan.

El trigo es el único cereal cuya harina rinde cantidades considerables de gluten y se utiliza esta determinación como índice de calidad de harinas. El gluten húmedo en harinas normales de trigo debe ser igual o mayor a un 25% y las cifras normales de gluten seco son de 9 a 12% en trigo blando y de 11 a 17% en el trigo duro. El límite mínimo admitido es de 5,5%.

Para esta determinación se mezcla a la harina con agua para formar una masa homogénea que se deja reposar 20 minutos, se elimina el almidón por medio de lavados con agua para obtener una masa gomosa muy extensible que representa al gluten húmedo, finalmente éste se lleva a la estufa a 100° C y luego a 140° C para obtener el gluten seco.

2. Determinación de caseína en leche. Método Walker del formaldehído

En estado puro la caseína es blanca, sin olor e insípida. Se encuentra en la leche en estado coloidal. Puede ser extraída por filtración usando un filtro de porcelana y las partículas de caseína tal como se presentan en la leche puede ser observada con

un ultra microscopio o por uso de un campo oscuro. La caseína se encuentra en la leche en combinación con el calcio en forma de caseinato de calcio. Este es precipitado por enzimas y alcoholes y por ácidos a un pH de 4,6. Los métodos oficiales del AOAC para determinación de caseína se basan en la precipitación de la caseína y determinación de nitrógeno en el precipitado lavado. La caseína precipita a menor temperatura que otras proteínas.

El método de Walker es un método de titulación formal en planta que puede ser utilizado para determinar proteínas totales. Este método se basa en el hecho de que las proteínas y sus productos derivados están relacionados con ciertos aminoácidos. Estas sustancias poseen propiedades básicas debido a al grupo amino (NH2,) y propiedades ácidas por el grupo carboxilo (COOH). Las proteínas al igual reaccionan con el formaldehído para formar derivados aminoácidos los cuales no poseen el grupo amino y por ende pierden sus propiedades básicas. Las proteínas tienen reacción neutra a la fenolftaleína pero cuando son tratadas con formaldehído tienen reacción ácida. La naturaleza general del cambio puede ilustrarse de la siguiente forma:

1. OBETIVOS:

• Practicar los procedimientos para la determinación cuantitativa de proteínas en la leche y harina de trigo

• Observar las distintas reacciones de las proteínas en la harina de trigo, harina de maíz y en la leche disuelta en agua ante la adición de reactivo de Biuret a las diferentes muestras

• determinar la concentración de proteína de un extracto diluido de hígado de ternera, el posterior cálculo de la concentración en el extracto crudo inicial y determinar el rendimiento de la extracción en forma de mg proteína / g de tejido.

1. MATERIALES:

• MUESTRAS: Harina de trigo, leche
• Placa petri
• Agitador
• Probeta
• Vidrio de reloj
• Matraz de 250 ml
• Bureta de titulación
• Soporte Universal
• Pipetas graduadas de 1, 2 y 10 ml

• Solución de yodo aproximadamente 0,001N
• Solución de fenolftaleína al 1%
• Solución de NaOH 1/10N
• Formalina neutro al 40%
• Estufa
• Desecador
• Balanza Analítica

1. PROCEDIMIENTO:

1.- DETERMINACIÓN DE GLUTEN EN HARINA DE TRIGO

* Pese 25 gramos de harina. Anote peso de muestra (Pm), mezclarla con 13 ml de agua de llave en la placa petri hasta obtener una masa homogénea, tape y deje reposar durante 20 minutos.

* Coloque la masa en la palma de la mano izquierda y amasarla bajo el goteo continuo del agua hasta que se arrastre todo el almidón, evitando que el agua arrastre porciones de la masa.

* Para comprobar la presencia del almidón, coloque en un vidrio de reloj unas gotas del agua que escurre de la masa con unas dos gotas del reactivo. La aparición del precipitado oscuro indica la presencia del almidón.

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