ESTRUCTURA BACTERIANA DE M. TUBERCULOSIS

ANEXO 1

ESTRUCTURA BACTERIANA DE M. TUBERCULOSIS

La estructura celular de M. tuberculosis consta de una gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio periplasmico, con cuatro capas:

La más interna es el glicopéptido o peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido N-glucolilmurámico (en lugar del habitual N-acetilmurámico). Esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas una por polímeros de arabinosa y galactosa, otra formada por ácidos micólicos y otra superficial formada por lípidos como los sulfolípidos, el cord factor, llamado así por su aparente asociación con la forma acordonada con que se agrupan las micobacterias virulentas, y los micósidos que son al igual que el anterior glicolípidos. No difiere del resto de las bacterias en cuanto al citoplasma y el ADN nuclear.

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ANEXO 3

OBTENCIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS

Esputo u otras muestras.

El esputo recogido por expectoración debe realizarse a primera hora de la mañana, en cantidad entre 5 a 10 ml.

Pequeños volúmenes, especialmente, menos de 2ml, puede bajar la probabilidad de detección de micobacterias

Exudado faríngeo debe realizarse sin previo aseo bucal a primera hora de la mañana. Y colocarlo en medio de transporte o solución fisiológica.

La orina Es la muestra habitual para llegar al diagnóstico de tuberculosis renal. No es necesario no recomendable el sondaje, ni la orina obtenida durante 24 horas. Para la obtención de la muestra, lo usual y más adecuado es recoger la primera orina de la mañana. Y deben ser mínimo 3 muestras.

Conservación y transporte

1.- El transporte rápido de las muestras al laboratorio es fundamental.

2.- La conservación deberá hacerse a 4ºC siempre que sea posible.

3.- Algunas muestras como esputos, sangre o heces pueden en caso necesario ser enviadas sin refrigeración. Los esputos consecutivos de tres días pueden por necesidades operativas almacenarse en frigorífico a 4ºC y llevarse al laboratorio los tres juntos el último día

DIAGNÓSTICO DE MUESTRAS CLÍNICAS

a) POR VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA

El hallazgo de bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en extensiones teñidas y examinadas al microscopio es la primera evidencia de la presencia de micobacterias en una muestra clínica. Es el procedimiento más facil y rápido que se puede efectuar y que aporta al clínico una orientación preliminar del diagnóstico.

La técnica clásica de Ziehl-Neelsen o sus variantes y la tinción con fluorocromos (auramina) son igualmente eficaces y se basan en el mismo principio. La mayor rápidez de la fluorescencia es la razón por lo que ésta justificada en aquellos laboratorios que realizan más de diez examenes microscópicos al día. La sensibilidad de la baciloscopia depende, en gran parte, de una buena preparación de la tinción y de la lectura

Los resultados del examen microscópico deben expresarse en número aproximado de bacilos visualizados.

La visualización de BAAR en esputo no es afirmativa de M. tuberculosis porque otras micobacterias pueden también causar enfermedad pulmonar. Sin embargo, una baciloscopia positiva en conjunción con la clínica y hallazgos radiológicos puede utilizarse para un diagnóstico presuntivo de micobacteriosis.

b) POR CULTIVO

Todas las muestras, deberían ser procesadas rutinariamente para microscopia y cultivo

Medios sólidos

El método tradicional de cultivo para micobacterias incluye la inoculación de varios medios sólidos o líquidos con y sin antibióticos. Un medio con base de huevo como el Lowenstein-Jensen es el más conocido. También los medios sin base de huevo como el Middlebrook 7HlO y 7Hll. Pero existen otros como el Ogawa Kudoh (OK) y el Stonebrink modificado por Giraldo (STG).

Metodos líquidos de lectura manual

El sistema Septi-Chek MB (Becton Dickinson) consiste en un medio bifásico de 20 ml. de caldo Middlebrook 7H9, enriquecido con CO2, suplementando con factores de crecimiento y antibióticos, al que se le acopla en el parte superior después de la inoculación de la muestra un dispositivo. Este dispositivo tiene tres medios de cultivo, por un lado un agar Middlebrock 7H11 no selectivo, que permite el crecimiento de la mayoría de las micobacterias y, por otro lado, dos secciones, una con un medio modificado de Lowenstein-Jensen, y otra con agar chocolate para detectar contaminaciones. El medio líquido es invertido sobre la fase sólida inicialmente y a intervalos durante la incubación. El sistema se revisa visualmente. El crecimiento se detecta tanto en el medio líquido como en la fase sólida.

Características de crecimiento

La mayoría de las micobacterias crecen bien a 37ºC. Sin embargo, hay micobacterias que requieren temperaturas inferiores de crecimiento, (M. marinum, M. ulcerans y M. haemophilum crecen a 30ºC) y otras que pueden crecer a distintas temperaturas lo cual orienta en su identificación (M. thermoresistibile es capaz de crecer a 52ºC y M. xenopi a 42ºC).

Puede observarse la morfología de las colonias crecidas directamente en Lowestein-Jensen y distinguirse si son colonias lisas, rugosas o mucosas. Pueden también observarse morfológicamente las microcolonias, según el método de Runyon (observación microscópia de las colonias a los 15 días del subcultivo en un medio transparente, Middiebrook 7H10).

La pigmentación que presentan las colonias de algunas especies de micobacterias son:

- Fotocromógenas.- Producen colonias no pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y dichas colonias se pigmentación con la luz. La forma de inducir esta propiedad se llama fotoinducción y se consigue exponiendo las colonias a la luz de una lámpara de 40W durante 60 minutos, tras lo cual se vuelve a incubar normalmente. Si las colonias se pigmentan, la cepa presenta fotoinducción y es fotocromógena.

- Escotocromógenas: Producen colonias pigmentadas cuando crecen, tanto expuestas a la luz como en la oscuridad. Para comprobar que la cepa es realmente escotocromógena es necesario hacer un subcultivo cubriendo el tubo con papel negro. La pigmentación puede ser de tres tipos y permite distinguir las especies: pigmento rosa o rojo (M. lactis), pigmento amarillo-naranja (M. gordonae) y pigmento irregular M. xenopi)

- No cromógenas: las colonias no se pigmentan en la oscuridad ni en la luz.

c) PRUEBAS QUIMICAS

Prueba de Niacina POSITIVA

Reducción de Nitratos POSITIVA

Prueba de la catalasa POSITIVA

Prueba de indol NEGATIVA

Prueba de producción de sulfhídrico (H2S) NEGATIVO

Fermenta glucosa y arabinosa SIN PRODUCCIÓN DE ÁCIDO

REACCIÓN DE TUBERCULINA

Técnica que permite detectar la reacción a la tuberculina mediante la inyección en la dermis de dicha sustancia. La reacción positiva (si el individuo ha tenido contacto con el bacilo de Koch o sufre la enfermedad) se detecta con la aparición de una reacción eritematosa e indurada en el punto de inoculación pasadas 48 o 72 hrs.

TÉCNICA DE ZIEHL NEELSEN

Fundamento

El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.

Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.

En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.

El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas porque su pared no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta decoloración se llaman ácido-resistentes.

Colorante secundario

Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante llamado colorante secundario. Generalmente se utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita.

El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-resistentes conservan el color rojo.

Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales son llamadas bacilos ácido-alcohol resistentes.

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