Electroforesis

FÍSICA

Módulo 3

Trabajo Práctico: Electroforesis

Comisión: 3-B

Grupo 4

Electroforesis

Objetivos:

Calcular la movilidad electroforética (μ) de los aminoácidos lisina y ácido aspártico.

Analizar las variables experimentales que afectan la distancia recorrida por una molécula cargada cuando la misma es sometida a un campo eléctrico.

Fundamentos

La electroforesis es una técnica separativa que se basa en el fenómeno de migración diferencial que experimentan partículas cargadas eléctricamente al estar bajo la influencia de un campo eléctrico. Es decir que puede ser una técnica tanto de preparación de una muestra como también de identificación cuantitativa de moléculas, ya que se pueden determinar ciertos electrolitos según su peso molecular. Para que la resolución de la técnica sea lo más confiable posible es necesario aplicar condiciones correctas para obtener una buena respuesta de los componentes a analizar.

La partícula cargada experimenta una fuerza de atracción o repulsión cuando se encuentra inmersa en un campo eléctrico. De este modo la misma se desplazará en el medio hacia uno u otro polo, dependiendo de su carga (carga negativa hacia el ánodo, carga positiva hacia el cátodo). Si el campo eléctrico es homogéneo, entonces el módulo de la fuerza eléctrica que actúa sobre la carga depende de la intensidad de dicho campo tanto como el valor de la carga en estudio.

La fuerza eléctrica imprime en un primer instante sobre la molécula cargada una aceleración, que provoca el movimiento de la misma. Pero sobre ella aparece una fuerza de rozamiento producto del fluido en el que está inmersa (buffer). La fuerza de rozamiento es proporcional a la velocidad de la partícula, tiene igual dirección pero sentido contrario.

Entonces la fuerza neta ejercida sobre la partícula será entonces la resultante entre la fuerza de rozamiento y la fuerza eléctrica.

En el momento que las fuerzas se compensen, la aceleración será igual a 0 y la velocidad de la partícula será constante, siendo esta la velocidad máxima alcanzada en el seno del fluido bajo un campo eléctrico uniforme. Como esta situación se alcanza a los pocos segundos, puede asumirse que la velocidad es siempre constante.

Entonces, la velocidad adquirida por una molécula depende de partícula en si (carga, tamaño y peso), de la viscosidad del medio, la intensidad del campo eléctrico, la fuerza iónica y el pH. Cabe destacar que el movimiento de las partículas también se encuentra condicionado a la difusión natural como también la temperatura de trabajo.

La temperatura afecta la velocidad con la que se desplaza la partícula por incidir en tres instancias específicas. En primer lugar, hay que considerar que la viscosidad del buffer es una constante física que depende de la temperatura, por ende el coeficiente de fricción variará según cual sea el valor de la viscosidad del medio a la temperatura de trabajo. En segundo lugar, la energía cinética intrínseca de las moléculas, que determina el fenómeno de difusión, está en relación con la temperatura. Por último, dadas ciertas condiciones de temperatura se ve afectada la evaporación del buffer lo cual altera su fuerza iónica.

La fuerza iónica es una medida de las cargas en solución, y estima la actividad de los electrolitos en solución según su carga y concentración. En esta técnica, la presencia de electrolitos en el medio tiende a contrarrestar la migración de la partícula en estudio, puesto que los contra-iones tienden a moverse en sentido contrario. Es decir que a mayor fuerza iónica menor velocidad de migración.

El pH influye sobre la carga que adquieren los grupos ácidos o básicos presentes en la molécula.

La movilidad electroforética se define como el cociente entre la velocidad de una molécula y el campo eléctrico al que está sometida. Podemos decir que la velocidad y el campo eléctrico son variables interrelacionadas, si aumenta el campo aumentará la velocidad, siendo la movilidad constante, ya que no depende del campo eléctrico aplicado. Entonces la movilidad electroforética es una constante física para una sustancia si se mantiene constante el medio y la temperatura. Por lo tanto, bajo iguales condiciones de corrida (igual buffer de corrida-fuerza iónica, pH y viscosidad-, igual campo eléctrico, igual temperatura), partículas que difieren en carga, tamaño y/o forma migrarán a distinta velocidad, y por ende recorrerán distinta distancia durante un mismo periodo de tiempo.

La expresión siguiente permite determinar la movilidad (μ) de una sustancia a partir de la distancia recorrida por la misma (d) y las condiciones de trabajo: voltaje aplicado (V) , longitud de soporte utilizado (L) y tiempo de corrida (t).

Se demuestra que si varía una de ellas, variará la distancia de corrida pero no la movilidad, dado que esta última es una propiedad característica de cada la sustancia en un determinado medio.

Materiales y Métodos:

Ver Guía de Trabajos Prácticos, “Electroforesis” (pág. 5 a 14); Versión 3.0/Módulo 3/Cátedra de Física/FFyB/UBA.

Resultados ( en todas las variables se trabajo con un buffer de pH =7,6)

Tabla 1 - Variable: Tiempo ( grupo 4)

Tiempo (±0.003) min Distancia (±0,2) cm ∆V (±10) Volt Longitud (±0,1) cm

Asp Lys

5,000 0,9 -0,6 200 10,0

10,000 1,8 -1,2 200 10,0

15,000 3,0 -1,8 200 10,0

20,000 3,9 -1,9 200 10,0

Asp (ácido aspártico)

Lys (lisina)

Tabla 2 - Variable: Tiempo ( grupo 3)

Tiempo

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