Equipos de Hstología

Los siguientes conceptos generales sobre fijación de una muestra biológica para su observación microscópica, combina los aspectos teóricos y prácticos sobre técnica histológica. Este formato digital permite acercar a los interesados los contenidos básicos actualizados sobre la temática, los cuales fueran desarrollados en el Manual sobre Métodos Histológicos.

por Víctor Hugo Tomasi

Conceptos Generales

"La fijación es esencialmente un método para la preservación de la morfología y composición química de lacélula. Durante la fijación, las sustancias albuminoides del tejido pasan del estado sol, como se encuentran en vida, al de gel, cuyo contenido de agua es menor. De esta manera, se detienen los procesos posmortem y las estructuras se conservan con un mínimo de artificios, preparándolas para tratamientos ulteriores (Thompson 1966, García del Moral 1993, Eltoum et al. 2001)".

Las muestras obtenidas, sean biopsias, necropsias, exudados, derrames o punciones, deben sumergirse rápidamente en el reactivo fijador previamente seleccionado, a fin de que los tejidos no sufran alteraciones estructurales producidas por los siguientes fenómenos:

1. Acción de enzimas locales que provoca procesos autolíticos en el tejido.

2. Proliferación de bacterias y hongos provenientes del medio ambiente o de la misma muestra, los cuales desarrollan en condiciones anaeróbicas.

3. Evaporación por desecación de los componentes tisulares con eliminación de gases por descomposición orgánica.

4. Contracción o dilatación osmótica, que produce distorsión tisular como consecuencia de la evaporación.

El reactivo fijador se debe seleccionar antes de comenzar con la toma de la muestra. La selección depende del objeto de estudio y del grado de organización macromolecular que compone cadatejido. En los componentes tisulares organizados, tales comocromosomas, fibras elásticas, regiones organizadoras del nucléolo, depósitos de glucógeno, entre otros, existe un gran número de fuerzas intermoleculares que actúan entre sí manteniéndolos unidos y estables y, por tanto, son menos vulnerables a la acción del reactivo fijador. Es decir que, si bien la actividad fijadora del reactivo es suficiente para detener los procesos posmortem, éste no produce alteraciones estereoquímicas importantes en aquellos componentes.

En cambio, en regiones tisulares menos organizadas, como es el caso de la matriz extra e intracelular, la preservación se vuelve más dificultosa, con producción de artificios de fijación, que incluye disolución de lipocompuestos, aglutinación de estructuras fibrilares próximas, halo perinuclear, difusión de inclusiones citoplasmáticas, dehiscencias, etc. Así por ejemplo, para realizar estudios de bandas cromosómicas se recomienda un fijador reductor de acción deshidratante (metanol); para estudios nucleares se emplean mezclas formólicas o alcohólicas ácidas, ya que se debe preservar no sólo la cromatina, sino también la matriz y membrana nuclear (Líquido de Clarke). Para el estudio de tejidos vegetales se utilizan líquidos deshidratantes con escasa fuerza iónica, Líquido FAA (Jensen 1962); en estudiosinmunohistoquímicos es aconsejable emplear reactivos fijadores reticulizantes (glioxal o formol).

Con el propósito de lograr una correcta fijación es conveniente tener en cuenta los siguientes puntos:

a. La muestra en estudio se debe seccionar, durante la macroscopía, en pequeños fragmentos de 5 mm de diámetro mayor para que el reactivo fijador alcance rápidamente las capas tisulares más profundas de la muestra. El seccionamiento se debe realizar con bisturí nuevo, a fin de evitar compresión mecánica que deforme la muestra en estudio. Este procedimiento constituye

el primer paso de todo estudio histológico.

Una muestra de células, tejido u órgano se puede obtener de un animal o vegetal vivo (biopsia) o muerto (necropsia). Las muestras biológicas que se reciben en el laboratorio deben venir fijadas desde el lugar de la toma para que las mismas estén adecuadamente preservadas. Tras ingresar los datos de la muestra en el Libro de Entrada del Laboratorio, el profesional especializado debe realizar un estudio macroscópico del espécimen, procediendo de la siguiente manera:

- Observación

- Pesaje y medición

- Palpación

- Fragmentación de la muestra

- Trascripción de todo lo anterior.

Durante la fragmentación de la muestra se deben obtener secciones pequeñas, de manera tal que uno de sus lados sea menor a 5 mm de espesor para asegurar la correcta infiltración de las sustancias químicas que se utilizarán posteriormente. Si se trata de células se deben extender sobre un portaobjetos formando una capa delgada que permita su visualización sin superposiciones celulares (frotis celular).

b. El volumen del agente fijador debe ser mayor que el volumen que ocupa la muestra (10:1). En caso de emplear reactivos que pierden su eficacia con rapidez, tal como sucede con la acetona (se evapora fácilmente), se debe renovar respetando siempre la misma relación volumétrica.

c. Los fragmentos seccionados y listos para ser procesados se deben transportar en bolsitas de gasa pendientes de un hilo, en cuyo extremo libre se coloca un rótulo con los datos identificatorios de la muestra escritos con lápiz. Desde hace algunos años, no obstante, se utilizan grillas plásticas “cassettes”, que facilitan la tarea de procesamiento y archivo. En ambos casos el reactivo fijador actúa homogéneamente por todas las caras de la muestra.

Si las muestras se sumergen en el líquido fijador sin el uso de estos contenedores es conveniente cubrir con gasa el fondo del recipiente para que la muestra no toque dicho fondo y se fije incorrectamente de ese lado. Las muestras que presentan grasa (biopsias de mama) o aire (biopsias de pulmón) tienden a flotar en el fijador y para evitarlo, se debe cubrir con gasa a fin de mantenerlas sumergidas en el reactivo.

d. La presión osmótica es un factor importante que generalmente no se tiene en cuenta. La capacidad de un fijador para provocar fenómenos de retracción o dilatación tisular depende principalmente de los cambios inducidos sobre la presión osmótica en los tejidos. La osmolaridad del plasma humano es alrededor de 290 mOs/Kg, por tanto, es razonable asumir que las células humanas actúan dentro de ese valor, mientras que entre especies hay pequeñas diferencias: 310 mOs/Kg en ratas, 270 mOs/Kg en tejidos vegetales.

De esta manera, en la práctica, se acepta trabajar entre 270 y 320 mOs/Kg. Si se trabaja bajo riesgo de evaporación del disolvente en el cual se disuelve el fijador es recomendable preparar soluciones fijadoras ligeramente hipotónicas para evitar que las sales que componen el sistema buffer del fijador se concentren.

De no considerarse tal recomendación podría suceder que cuando se somete un tejido a la acción de un reactivo fijador y la presión osmótica entre ambos no es coincidente, se produzca un flujo de agua entre el fijador y el tejido en función de un fenómeno de ósmosis hasta que la presión entre ellos se equilibre. Si la presión osmótica del tejido es superior a la del fijador, el agua difunde hacia el interior del tejido, produciéndose dilatación y posterior destrucción celular. En cambio, el agua del tejido fluye hacia el exterior del espécimen y ocurre una retracción tisular, si la concentración de las sales del fijador es superior. De esta manera, la concentración de iones fosfatos, cloruros, sodio o potasio del buffer-disolvente del fijador debe ser isotónica respecto a la osmolaridad del tejido.

La osmolaridad de una solución fijadora se mide a través de la elevación de su presión de vapor en un Osmómetro. Sin embargo, esta medición puede evitarse, tras preparar la solución fijador-buffer empleando las proporciones indicadas en el punto siguiente. Por otra parte, antes de fijar la muestra es conveniente lavarla con solución fisiológica (ClNa 0,9% que equivale a 280 mOs/Kg y cuya molaridad es de 0,15M) para evitar la producción de artificios de técnica debido a la susceptibilidad que tienen los tejidos de dilatarse o contraerse cuando se los sumergen en líquidos hipo o hipertónicos.

e. El potencial de hidrogeniones (pH) debe ser el adecuado. Así por ejemplo, se sabe que a pH inferior a 5.0, las proteínas del tejido se fijan lentamente con formol, mientras que a pH superiores a 7.2, la unión entre este agente fijador y dichas proteínas es más rápido y, por tanto, los procesos autolíticos desencadenados por enzimas se detendrán con mayor efectividad (Baker 1958). En la literatura, sin embargo, hay desacuerdos para establecer relaciones directas entre la concentración de hidrogeniones y el tipo de tejido en estudio. Esto se atribuye, parcialmente, a las impurezas químicas que presentan los reactivos utilizados en los laboratorios biológicos, ya que depende de la marca comercial empleada. El pH se controla con soluciones buffer, el cual oscila, generalmente, entre 6.9 y 7.4, más precisamente 7.2. Así por ejemplo, para preparar formol buffer al 4% se debe mezclar:

Fosfato monopotásico ..... 0.20 gr

Cloruro de potasio ........... 0.20 gr

Fosfato disódico .............. 0.93 gr

Cloruro de sodio .............. 8.00 gr

Formaldehído .................. 100 ml

Agua destilada c.s.p. ....... 900 ml

Los efectos indeseados que pueden producirse por el uso de soluciones fijadoras no tamponadas se manifiestan, fundamentalmente, en

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