Estabilización de Proteínas para Almacenamiento

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Estabilización de Proteínas para Almacenamiento

INTRODUCCIÓN

Después del aislamiento y la purificación, a menudo es necesario almacenar proteínas y péptidos durante largos períodos de tiempo antes de realizar proteómica biofísica, enzimática y estructural detallada. Por lo tanto, es esencial que la proteína diana pura mantenga su comportamiento biológico (o funcional) original durante un período prolongado de almacenamiento que puede oscilar entre semanas y años. Los productos farmacéuticos proteicos deben permanecer viables después de un envío y almacenamiento extensos, y deben permanecer desprovistos de todos los posibles procesos de inactivación. La vida útil de una proteína depende tanto de la naturaleza intrínseca de la proteína como de las condiciones de almacenamiento. Las proteínas (especialmente las enzimas) deben almacenarse a una temperatura y un rango de pH adecuados y, con frecuencia, en presencia de glicerol concentrado (~1 M), sacarosa o una sustancia similar. para que las proteínas retengan la actividad y eviten la agregación. Este artículo analiza las principales causas de la inactivación de proteínas y describe una serie de medidas que se pueden adoptar para mantener la estabilidad y la solubilidad de las proteínas.

INFORMACIÓN RELACIONADA

En este artículo se analizan varios métodos de purificación de proteínas en relación con la estabilidad de las proteínas. Parapara obtener más información acerca de la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, consulte Optimización de las concentraciones de imidazol para cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (Haneskog 2006a) y Purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados bajo concentraciones optimizadas de imidazol (Haneskog 2006b). El uso de resinas de afinidad se describe en Cromatografía de afinidad de lectina-agarosa (Brocklehurst et al. 2006a) y Cromatografía de afinidad de proteína ligando (Brocklehurst et al. 2006b). Las resinas de intercambio iónico se analizan en Preparación de una columna de intercambio iónico (Westerlund 2006a) y Separación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico (Westerlund 2006b). Los detalles de la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC) se pueden encontrar en Condiciones cromatográficas estándar para RP-HPLC de proteínas (Carr y Moritz 2006). Para obtener detalles sobre la caracterización de preparaciones de proteínas purificadas mediante SDS-PAGE analítica, consulte SDS-PAGE of Proteins (Simpson 2006). La Figura 1 ilustra la pérdida de proteína con el tiempo de almacenamiento.

MUCHOS FACTORES CAUSAN LA INACTIVACIÓN DE PROTEÍNAS DURANTE LA PURIFICACIÓN Y EL ALMACENAMIENTO

Se puede demostrar que casi todas las propiedades de una proteína, excepto su secuencia primaria de aminoácidos, varíancon el pH, la temperatura y la concentración de iones del disolvente. Cuando se eliminan de su entorno celular natural, las proteínas están sujetas a una variedad de factores externos que pueden conducir a una pérdida (o deterioro) de su actividad biológica como resultado de alteraciones estructurales tanto covalentes como no covalentes. Los factores que pueden afectar la actividad biológica de una proteína incluyen los siguientes:

• Alteraciones en las condiciones de la solución (p. ej., dilución, temperatura y pH)
• Pérdida de un cofactor esencial
• Exposición a proteasas, oxígeno o metales pesados
• Cambios en las condiciones físicas como congelamiento y descongelamiento

Adaptado de Purifying Proteins for Proteomics (ed. Simpson). CSHLPrensa, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 2004.

Citar como: Frío Primavera Harb protocolo; 2010;doi:10.1101/pdb.top79        www.cshprotocols.org

FIGURA 1.Proteína pérdidas durante almacenamiento. liofilizado proteína normas eran disuelto en H2O y almacenado en polipropileno tubos en 4°C. En varios tiempo periodos, a pequeño parte de cada[pic 5]

muestra (4 μL) era retirado a estimar el proteína contenido.

cuantificación era basado en cima área siguiente RP-HPLC en a micro-fase invertida columna usando a trifluoroacético ácido/ace- tonitrilo elución sistema. Proteínas: (mEGF) murino epidérmico crecimiento factor (EGF); (rhEGF) recombinante humano FEAG; (a.lact) α- lactoalbúmina. Proteína pérdidas durante almacenamiento eran eludido por inclusión de 0,02% (v/v) (final concentración) interpolación 20 en el muestra. Datos eran amable proporcionó por CE Lindo (ludwig Instituto, Melbourne).

Comprender los factores que influyen en la actividad de una proteína en particular (y las precauciones que se pueden tomar para minimizar sus efectos) contribuye en gran medida a una estrategia de purificación exitosa y al almacenamiento prolongado de una proteína objetivo.

Debe enfatizarse que si ocurre una pérdida de actividad durante el aislamiento y la purificación de una proteína objetivo, es importante determinar si la pérdida se debe a una pérdida física de la proteína, per se, a la inactivación química (ver Tabla 1), oa la inactivación causada por el desdoblamiento de proteínas (ver Tabla 2). Para revisiones sobre el despliegue de proteínas, consulte Privalov (1979, 1990), Franks (1993) y Baldwin y Rose (1999a,b). Una variedad de enfoques experimentales están disponibles para medir la estabilidad conformacional de las proteínas. Los más importantes son la electroforesis en gel (Goldenberg 1997; Pace y Scholz 1997), la espectroscopia óptica (Schmid 1997) y el análisis inmunológico (Friguet et al. 1997). Conocer la(s) causa(s) subyacente(s) de la inactivación de proteínas será de gran ayuda para llegar a una solución adecuada al problema.

LAS REACCIONES QUÍMICAS AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS

Una serie de reacciones de inactivación de proteínas bien definidas pueden ocurrir tras la purificación y/o el almacenamiento en condiciones moderadas de pH y temperatura (consulte la Tabla 1). Además de provocar la modificación de proteínas, estas reacciones también pueden provocar la pérdida de actividad biológica.

Formación de succinimida (imida cíclica) después de la desamidación

La formación de -isoaspartato como resultado de la desamidación de residuos de asparaginilo o la isomerización de residuos de aspartilo es una fuente importante de inestabilidad en proteínas y péptidos, especialmente a pH neutro o alcalino (Geiger y Clarke 1987; Aswad 1995). Por ejemplo, la disposición de un residuo de asparagina seguido de un pequeño residuo de aminoácido hidrofílico como glicina, serina o treonina en una cadena polipeptídica puede provocar la desamidación de una asparagina y la formación de ácido -aspártico y/o - isoaspartato. Este fenómeno ocurre a través de un reordenamiento intramolecular que produce un intermedio de succinimida (imida cíclica) a un ritmo rápido y transmite una carga negativa adicional a la proteína (Bornstein y Balian 1977; Stephenson y Clarke 1989; Kwong y Harris 1994). Se ha informado que la formación de -isoaspartato se produce en la hormona de crecimiento humana recombinante (Johnson et al. 1989) y la eritropoyetina (Derby et al. 1996a,b) tras un almacenamiento prolongado. Para métodos de identificación de la presencia de residuos de isoaspartilo, véase Di Donato et al. (1986, 1993) y McAtee y Zhang (1997). La formación de intermediarios de succinimida también puede conducir a la escisión espontánea de enlaces peptídicos, como se informa en el envejecimiento.

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