Fuerzas intermoleculares. Espectrofotometría

Espectrofotometría

Fecha de entrega 21/03/2018

GIL, Juan Camilo1; GUERRA Q., Laura Camila2; PANTOJA C., Lady Daniela3; VIDAL A., Karen Johana4.

Universidad Santiago de Cali
Informe presentado al Prof. Dra. Luz Dary Caicedo

e-mail: jcamilogil@hotmail.com1, lauraguerra1999@hotmail.com2, leidypantoja97@gmail.co3, karen.vidal02@usc.edu.co4.

Se determinó la longitud de onda de máxima absorción de dos sustancias: azul de bromotimol pH ácido y de una mezcla de rojo Congo con azul de bromotimol pH 7.5, mediante el espectro de absorción de luz visible de cada una de ellas en el espectrofotómetro. Con lo anterior se comprobó la relación entre absorbancia y la concentración de las muestras siguiendo la ley de Beer-Lambert, con lo cual se determinó la concentración de una sustancia problema.

Palabras clave: Espectrofotómetro, espectrofotometría, ley de Beer- Lambert, espectros de absorción,  

1. Introducción

Una característica importante de los compuestos químicos es su coloración. La intensidad de la coloración es ampliamente utilizada en los ensayos bioquímicos. La luz visible que es captada por el ojo humano ocupa una porción restringida del espectro electromagnético que abarca de los 400 a los 800 nm. Para la investigación bioquímica se utiliza tanto el espectro visible como el ultravioleta que abarca entre los 200 y 800 nm.4

Para cuantificar las reacciones coloridas se desarrolló un instrumento denominado espectrofotómetro que es capaz de producir luz monocromática y medir la cantidad de luz absorbida por una muestra. Los espectrofotómetros están integrados de cinco componentes: fuente luminosa, monocromador, filtro, cámara para la colocación de la muestra, detector y la unidad electrónica para la captura de datos.4 Se basa en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, como consecuencia de lo cual se origina un estado activado que posteriormente elimina su exceso de energía en forma de calor. La cantidad de calor disipado es muy pequeño, por lo que el método tiene la ventaja de originar un trastorno mínimo en el sistema que se estudia.1

Por medio de un espectro de absorción, se determina la longitud de onda (λ) óptima de absorción de una sustancia dada. El espectro de absorción de una sustancia se obtiene midiendo la absorbancia de la muestra a diferentes longitudes de onda; si se trabaja en el espectro visible, el rango de medición es desde 400 nm hasta 700 nm. Luego, se grafica la absorbancia vs. La longitud de onda, y se encuentra la longitud de onda que corresponde con el punto máximo de absorción de la muestra; este es el valor de longitud de onda con el que se trabajará en el análisis cuantitativo.2

En cuanto a la región ultravioleta, hay que indicar que la zona de mayor interés en la práctica analítica ordinaria es la denominada como ultravioleta próximo (longitud de onda entre 200 y 400 nm), pues el ultravioleta lejano o ultravioleta de vacío (de 10 a 200 nm) presenta el inconveniente.1 Al incidir un haz de luz de determinada longitud de onda sobre una muestra, parte de esta luz es absorbida y la otra parte es reflejada o transmitida. La cantidad de luz absorbida por la muestra es directamente proporcional a la concentración de la muestra (a mayor concentración, mayor absorción y menor transmisión) y a la longitud del cuerpo atravesado por el haz (ancho de la cubeta). Por lo tanto:2

A = εe.c.l

A= absorbancia, e= coeficiente de extinción molar, c = concentración de la muestra, l= diámetro de la cubeta.

Dado que el coeficiente de extinción molar e, es una constante para cada sustancia y el diámetro de la cubeta l, también es fijo, la absorbancia depende directamente de la concentración de la sustancia. Esto se conoce como la ley de Beer y Lambert. Esta ley se cumple solo entre ciertos rangos de concentración, que varían de una sustancia a la otra, por lo que debe comprobarse su aplicación para cada metodología que se utilice.2

En la práctica, si el espectrofotómetro da únicamente lecturas de porcentaje de tramitancia %T, puede hacerse la conversión a absorbancia, A, mediante la fórmula:2

A = 2-log %T

1. pROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Determinación de los espectros de absorción.

• Se determinó el espectro de absorción del azul de bromotimol a pH ácido de la siguiente manera: en dos tubos de ensayo se prepararon las siguientes sustancias: al primer tubo se le añadieron 10 ml de agua destilada el cual sirvió como blanco y al otro tubo se le añadió 1 ml de  azul de bromotimol (100 mg/l), 9 ml de agua destilada y una gota de ácido acético al 5% y se mezcló bien.

Luego se agregó cada una de las sustancias en diferentes tubos para espectrofotometría con ayuda de una micropipeta y se determinó el espectro de absorción midiendo la absorción de luz en el espectrofotómetro cada 30 nm, desde 400 hasta 700 nm, efectuando una calibración previa con el blanco a 100% de tramitancia entre cada lectura.

Se realizó la gráfica (absorbancia vs. longitud de onda en nm) con los datos obtenidos y con ella se determinó la longitud de onda de máxima absorción de esta sustancia.

• Se determinó el espectro de absorción de una mezcla de bromotimol y rojo Congo pH 7.5 de la siguiente manera: en dos tubos de ensayo se prepararon las siguientes sustancias: al primer tubo se le añadieron 10 ml de agua destilada la cuál sirvió como blanco y al segundo tubo se le añadió 1 ml de azul de bromotimol (100 mg/l), 1 ml de amortiguador de fosfatos pH 7.5, 1 ml de rojo Congo (100 mg/l), 7 ml de agua destilada y se mezcló bien.

Luego se agregó cada una de las sustancias en diferentes tubos para espectrofotometría con ayuda de una micropipeta y se determinó el espectro de absorción midiendo la absorción de luz en el espectrofotómetro cada 30 nm, desde 400 hasta 700 nm, efectuando una calibración previa con el blanco a 100% de tramitancia entre cada lectura.

Se realizó la gráfica (absorbancia vs. longitud de onda en nm) con los datos obtenidos y con ella se determinó la longitud de onda de máxima absorción de esta sustancia.

2. Comprobación de la Ley de Beer-Lambert.

Se comprobó la Ley de Beer-Lambert con azul bromotimol a pH ácido, preparando en 8 tubos de ensayo las siguientes diluciones, partiendo de la solución original de azul de bromotimol (100mg/L) para obtener diferentes concentraciones:

Tubo 1: 0.25 ml de azul de bromotimol a pH ácido, 9.75 ml de agua destilada y 1 gota de ácido acético.

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