Homogenización De Tejidos

Se trata de romper las células o tejido con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogeneizador.

• Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células.

• Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse.

Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de las células con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estén todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos físicos.

Homogenizador de Esfera

Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.

Tamaño de esferas:

• mm: Bacterias, esporas.

• 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.

• 1.0, 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas.

• La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.

Homogeneizador de émbolo y tubo

Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.

Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales. Preferido en preparación de organelos subcelulares de tejidos frágiles como cerebro e hígado. (Acción suave). Permite un mejor control de la temperatura generada por la fricción. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos

Blenders (Licuadora)

Homogenización por uso de cuchillas. Proceso magnificado por uso de solventes orgánicos y/o detergentes. Cuchillas rotan a 6.000 – 50.000 rpm en un contenedor. Las muestras se pueden reducir hasta partículas de 4 micrones (análisis de citometría de flujo). Procesamiento de tejidos animales y vegetales. No adecuado para fraccionamiento de microorganismos. Homogenizados de plantas pueden sufrir oxidación enzimática.

Homogenizador Rotor/Stator

Molinos de coloides – H. Willems. Homogenización rápida (10-60 seg.) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales y vegetales. Genera calor a niveles insignificantes. Formación de espuma y aerosoles

SHOCK OSMOTICO

La células se hacen estallar al someterlas a un medio hipotónico, lo cual hace que la membrana no resista la presión osmótica. Puede ocasionar el daño a las membranas de algunas organelas.No se recomienda porque en algunas Organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitóticos

MORTERO Y MANO

Es un método convencional de rompimiento por fricción. Pueden emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o materiales silíceos. La masa celular contenida en un volumen de buffer se mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 – 1). La fricción sobre las células genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. Actualmente se dispone de homogenizadores más sofisticados que emplean el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de fricción y la temperatura del proceso, son conocidos como potters. Los principales problemas de esta técnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeñas cantidades de medio moledor ó cuando es baja la concentración celular; la fricción genera calor y pueden presentarse alteración en las proteínas

SONICACION

Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidad generándose ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscópicas, las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. Este fenómeno llamado cavitación puede incrementarse adicionando al medio finísimas esferas de vidrio.

Ultrasonificación

Generación de intensas ondas sónicas en medio líquido. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad generándo ondas ultrasónicas que forman millones de microburbujas que se expanden y colapsan contra las células:

CAVITACIÓN.

Choque de ondas rompe membranas y aún enlaces covalentes. Mayor acción por adición de esferas de vidrio. El Sonicador tiene dos forma de operar, por Pulsos: Las Vibraciones de ultrasonido pueden transmitirse en una solución en un rango de 0,1 a 0,9 pulsos por segundo, permitiendo una adecuada sonicación sin generación importante de calor y Continuo: Puede ser usado de forma contínua por hasta 15 minutos. Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos o de E.Coli con 40 segundos. Presneta los siguientes inconvenientes: alta generación de calor de las muestras que se mantienen en congelamiento, los tejidos duros (piel o tendón) se deben macerar previamente; se pueden generar radicales libres, el daño por oxidación de radicales libres puede minimizarse adicionando cisteina, ditiotrteitol o algún otro componente -SH en el medio. Por Radicales Libres: Lesión en membrana celular, aberraciones, cromosómicas menores y cambios de tipo Fisiológicas. Uso en Transferencia de DNA plasmídico en Protoplasmos y células intactas; con expresión temporal de un gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Células en Suspención y en fragmentos de tejido con la misma sencillez.

COMPRESION - DESCOMPRESION. Picador / prensa de sólidos

Se emplea la prensa francesa, consiste en el paso de las células a gran presion por un pequeño orificio a una cámara con presión baja, lo

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