INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA
Enviado por yamilet flores zevallos • 22 de Septiembre de 2022 • Documentos de Investigación • 1.895 Palabras (8 Páginas) • 42 Visitas
PRÁCTICA N° 4
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA
En esta práctica, emplearemos a la fosfatasa alcalina como modelo. Aprenderemos a calcular los dos principales parámetros cinéticos de las enzimas, la constante de Michaelis-Menten (KM) y la Velocidad máxima (Vmax), para lo cual utilizaremos la representación de Michaelis-Menten y para obtenerlos en forma exacta, las representaciones de Lineweaver-Burk, Eadie Hoffstee, Hanes y Eisenthal Cornih-Bowden
Utilidad de determinar KM y Vmax de una enzima
La KM establece un valor aproximado para el nivel intracelular de sustrato. Es poco probable que este nivel sea apreciablemente mayor o menor que KM. Si [s]i « KM, la velocidad será muy sensible a cambios de [s]i, pero no se utilizará todo el potencial catalítico de la enzima, pues la velocidad siempre será menor que Vmax. Por otro lado, si [s]i » KM, la velocidad será insensible a pequeñas diferencias de [s]i. En esas condiciones, la diferencia entre la velocidad correspondiente a [s]i = KM y la correspondiente a [s]i » KM seria sólo el doble.
Midiendo los efectos de diferentes compuestos sobre KM y Vmax, se pueden identificar inhibidores enzimáticos y el tipo de inhibición que producen.
La KM indica la afinidad relativa de los distintos compuestos que pueden ser sustratos de una determinada enzima. Conociendo KM se pueden ajustar las condiciones de ensayo, de manera que [s] » KM ([S]>10KM) y así determinar Vmax, que es proporcional a la cantidad total de enzima {Vmax = K2 [Et]}.
Para el cálculo de KM y Vmax se necesita medir la velocidad inicial de la reacción a distintas concentraciones de sustrato, utilizando una concentración constante y una adecuada cantidad de enzima. Para ello, se realizan primero varias curvas de progreso (absorbancia frente a tiempo) utilizando distintas concentraciones de sustrato.
[pic 1]
La pendiente de la tangente a la curva de progreso para t=0 es la velocidad inicial (V0). Si la primera parte de la curva es lineal, no es necesario trazar la tangente en el origen y basta calcular la pendiente en esa zona lineal:
Para cada concentración de sustrato será: V0 = A2-A1
t2-t1
Como se conoce la [S], tenemos para cada [S] una velocidad, con esos datos se calcula Vmax y KM. Con 5 datos es suficiente calcular estos parámetros, pero si se obtienen muchos datos hay que saber escogerlos
Determinación de KM y Vmax de fosfatasa alcalina
PARTE EXPERIMENTAL
Usaremos suero sanguíneo como fuente de fosfatasa alcalina y como sustrato, el p-nitrofenilfosfato (pNFP). La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis del pNFP a p-nitrofenol (pNF) y fosfato, en un medio alcalino. La reacción se detiene con NaOH (muy concentrado); el p-nitrofenol (pNF) en solución alcalina es amarillo (porque se transforma en p-nitrofenolato) y su concentración puede ser determinada espectrofotométricamente, a 405 nm. La absorbancia de la solución (intensidad de color amarillo) es una medida de la concentración del producto.
[pic 2]
Procedimiento experimental:
La práctica tiene dos partes:
3.1. Construcción de la curva patrón para el pNF, eje “x” [pNF], eje “y” absorbancia
3.2. Efecto de la [S] sobre la actividad de fosfatasa alcalina, para calcular KM y Vmax
Materiales
-‐ Tubos y pipetas.
-‐ Agua destilada.
-‐ Tampón Tris 10 Mm pH 9,6.
-‐ Soluciones de p‐nitrofenol (pNF): 15, 30, 60 y 90 µM
-‐ Soluciones de p‐nitrofenil‐fosfato (p‐NFP): 2.5, 5, 7, 10 y 15 mM
-‐ NaOH 0,2N.
-‐ Suero humano.
-‐ Espectrofotómetro.
-‐ Baño a 37°C.
-‐ Calculadora.
3.1. Curva patrón de pnitrofenol
Preparar los siguientes tubos patrón de p‐nitrofenol (pNF, producto):
TUBO | Blanco | 1 | 2 | 3 | 4 |
Tris pH 9,6 | 2,2 ml | 2,2 ml | 2,2 ml | 2,2 ml | 2,2 ml |
Agua destilada | 1 ml |
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Soluciones patrón pNF |
| 1ml (15µM) | 1ml (30µM) | 1ml (60µM) | 1ml (90µM) |
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