Manual de prácticas del Laboratorio de Cultivo de tejidos

Manual de prácticas del Laboratorio de Cultivo de tejidos

Universidad Autónoma de Sinaloa[pic 1][pic 2]

Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Licenciatura en Biotecnología Genómica

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I.- OBJETIVOS

1. Conocer los componentes de un medio de cultivo internodos y familiarización con las técnicas de cultivo de tejidos.
2. Aprender la técnica de corte de nodos en plantas.
3. Conocer las diferentes etapas del sistema de micropropagación in vitro vegetal.
4. Aprender la técnica de traspaso de plántulas de in vitro a ex vitro.
5. Conocer la importancia del proceso de adaptación de las plantas a suelo.

II.- INTRODUCCIÓN

La micropropagación consiste en la proliferación de plantas en un ambiente artificial controlado, empleando un medio de cultivo adecuado. El cultivo es así una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales; esto, es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. Así, las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posea y al estímulo que reciban. Dependiendo de las características de la planta que se pretenda propagar y del objetivo perseguido, la micropropagación puede realizarse a través de tres vías de regeneración: brotación a partir de internodos (yemas adventicias preexistentes), producción de yemas de novo y embriogénesis somática. La vía más frecuentemente utilizada de micropropagación vegetal, es la conocida  comúnmente como “cultivo de internodos”, la cual es la que proporciona, bajo las condiciones químicas, físicas y biológicas apropiadas, los resultados en tiempos cortos. 

La micropropagación presenta cuatro etapas principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicación de vástagos o embriones, 3) enraizamiento y 4) aclimatación de las plántulas a suelo. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatación pueden combinarse en condiciones ex vitro.

III.- MATERIAL Y EQUIPO

• Frascos de cultivo in vitro conteniendo 2 cm de medio MIT
• Plántulas in vitro
• Mechero de alcohol
• Campana de flujo laminar
• Alcohol
• Pinzas
• Plástico para emplayar
• Aluminio
• Bisturí con navajas estériles

IV.- TÉCNICA

4.1.- Preparación de medio de internodos (1 L)

4.43 g/L de MS

15 g/L de sacarosa

8 g/L de agar

Ajustar pH=5.8

Esterilizar en autoclave

Servir 2 cm por frasco en campana de flujo laminar

4.2.- Corte de nodos

1. Primeramente se esteriliza completamente la campana con alcohol, y a su vez se introduce en ella todo el material a utilizar (pinzas, bisturí, navajas, aluminio, frascos con alcohol, mecheros de alcohol, frascos con M.I.T. y planta de tabaco). Todo debe ser esterilizado con alcohol antes de introducirlo en la campana.
2. Antes de comenzar es necesario quemar un pedazo de aluminio en donde se colocarán las pinzas con las que se trabajará. Además deben esterilizarse todos los herrajes (pinzas y bisturí) al rojo vivo antes de empezar a trabajar con ellos.
3. Una vez esterilizado el material, comenzamos con el corte de la planta de tabaco ayudándonos con las pinzas; Se cortan los nodos tal y como se practicó previamente, y tal y como se ilustra en el dibujo superior.
4. Se siembra el nodo en el medio de cultivo dentro del frasco, asegurándose que la parte correspondiente al tallo quede en dirección al medio de cultivo.
5. Una vez cultivado el nodo cerramos el frasco y emplayamos con plástico.
6. Se saca el frasco cerrado de la campana de flujo laminar y se coloca en el estante con iluminación para dejarlo germinar durante 2 semanas en condiciones de 16/8 hrs de luz/oscuridad.
7. Pasadas las dos semanas se revisa el desarrollo de la planta.

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Figura 1. Yemas axilares vegetales (Internodos). Nota: si la hoja es muy grande puede prescindir de ella.

V.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

VI.- PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS

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