Microscopia y analisis de imagenes

CURSO DE MICROSCOPÍA Y ANÁLISIS DE IMÁGENES

-E N S A Y O-

Uno de los tipos de microscopía convencional más ampliamente difundidos es la microscopía confocal. Un método diseñado para reducir el efecto de la difracción, sin embargo, su resolución es limitada en virtud de que la apertura empleada en este procedimiento no puede ser infinitamente pequeña. Mientras la apertura se reduce, la eficiencia en la detección es menos eficiente. Por ello se han propuesto varios métodos de super-resolución basados en la microscopía confocal buscando superar la barrera de la difracción. Tal es el caso de la microscopía diferencial por emisión de fluorescencia, microscopía de depleción por emisión estimulada o los métodos recientemente propuestos por Sheppard como la microscopía de reasignación óptica de fotones, microscopía de escaneo de imágenes, microscopía de reasignación de pixeles o la tecnología Airyscan de Zeiss, un tipo de microscopía de escaneo laser confocal.

Estos métodos están basados en la incorporación de detectores que llevan a cabo una detección paralela usando un arreglo de sensores dispuestos en un patrón de panal (Fig. 1), eliminando la necesidad de un agujero estenopéico, después la información es procesada empleando diferentes algoritmos, resultando una imagen final con calidad de super-resolución.  

En la microscopía confocal tradicional se pueden emplear diferentes tamaños de estenopéicos para la captura de la imagen. En los sistemas de super-resolución se puede emplear el detector central como referencia y la información periférica captada por los detectores paralelos usarse como diámetros más amplios mediante su función de transferencia.

 La microscopía diferencial de emisión de fluorescencia permite obtener una imagen de alta resolución mediante un proceso de sustracción basado en la ecuación siguiente:

IFED= IC – r x IN

Donde IC, IN corresponden a valores de intensidad normalizada de la imagen confocal y confocal negativa respectivamente; “r” representa el factor de sustracción. IFED es la imagen resultante de la diferencia de emisión de fluorescencia. Este procedimiento implica hacer dos escaneos y la disposición de dos haces de luz alineados coaxialmente. Sin embargo, el procedimiento puede simplificarse empleando detectores paralelos y un solo rayo de luz como en el ejemplo anterior y obteniendo la información de solo dos diferentes anillos.

En la microscopía Airyscan la información de 32 detectores paralelos es convolucionada al centro y colectada a partir de 32 canales diferentes mediante un haz de fibras conectadas a un sensor lineal de fosfuro de galio y arsénico.

La imagen resulta de la suma de las intensidades obtenidas de cada elemento y el ajuste de la convolución, es decir, un algoritmo de desconvolución. La imagen final tiene propiedades de super-resolución con un aumento de la relación ruido-señal.

Por otro lado, la microscopía óptica de modulación virtual de vector-k (Vikmom) es un tanto más compleja que los métodos anteriores. Luego de obtener la imagen la información es convertida a una base de datos de microscopía de iluminación estrucuturada (SIM data). La imagen es escaneada punto-punto, un proceso semejante al empleado en cámaras CCD pero con mayor precisión dado que cada punto es detectado también individualmente. El proceso de construcción de la imagen implica un proceso de análisis de la transformada de Fourier así como de la función de transferencia de las aberraciones. El resultado es una imagen de una resolución superior de Vikmom respecto al resto de las técnicas descritas anteriormente.

Finalmente, el efecto de reducir el tamaño del estenopéico en la microscopía confocal es el aumento en la calidad de una imagen, sin embargo, el beneficio es limitado. El beneficio de emplear múltiples canales de recolección paralela, convertir la información en una base de datos y someterla a un ajuste matemático por algoritmos de recuperación se traduce en mayor velocidad de captura y menor distorsión.

La microscopía multifoton también ha ganado popularidad en la ciencia por su capacidad para generar imágenes de alta resolución espacial y temporal principalmente en ambientes de alta dispersión óptica. La posibilidad de modificar la velocidad de los pulsos laser, su frecuencia, los espacios de tiempo entre pulsos, la especificidad molecular y ampliar las ventanas de tiempo tras la estimulación como es el caso de la microscopía “pump-probe” ha sido bien recibida por la comunidad científica. Este tipo de microscopía puede detectar marcas moleculares que no fluorescencia. Con ello se pueden detectar cambios en ambientes intracelulares como los que suceden durante el disparo neuronal, fenómeno inaccesible a otras técnicas. La limitación más importante en esta técnica es la necesidad de proveer dos o más trenes LASER ultracortos, estables y bien sincronizados.

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