PREPARACION DE MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE ESTERILIZACION

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRACTICA No. 1

PREPARACION DE MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE ESTERILIZACION.

OBJETIVO:

Familiarizar al alumno con  la preparación y el manejo  de los medios de cultivo y material de laboratorio por medio del conocimiento de las características de los mismos y condiciones a establecer para el  aislamiento e identificación de microorganismos en el laboratorio.

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MARCO TEORICO

Los medios de cultivo microbiológicos son el sustrato o solución de nutrimentos en que se cultivan los microorganismos en el laboratorio, pueden ser de diferentes tipos: líquidos, sólidos y semi-sólidos. Los medios de cultivo sólidos (medios o agares) contienen agar-agar que es un preparado proteico de especies de algas marinas el cual solidifica a 47°C y funde a 98°C, su concentración en estos medios de cultivo es de un 2%, la ventaja de estos medios sólidos es que facilitan la identificación de colonias de microorganismos en desarrollo. Los medios de cultivo líquidos no contienen agar-agar, por lo que se les denomina caldos de cultivo y están constituidos exclusivamente por nutrimentos específicos, los cuales dependen del tipo de microorganismos que se desee cultivar.

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En el laboratorio de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios, estos varían ampliamente de acuerdo con las necesidades particulares de los microorganismos bajo estudio. Algunos contienen lo necesario para el crecimiento en forma cruda, es decir, que no se conocen todos los componentes del medio ni se saben las cantidades exactas en que están presentes. Muchos de los componentes son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos tejidos vegetales, carnes, caseína y células de levadura, que según la substancia de que se trate, proporciona fuentes ricas en polipéptidos, aminoácidos, vitaminas o sales minerales. Ejemplos específicos de tales componentes son las peptonas o triptonas, las cuales son  hidrolizados  enzimáticos de proteínas animales y el extracto de levadura, que es un autolizado de levadura rico en vitaminas del complejo B. En estos digeridos crudos suelen estar presentes algunos carbohidratos o bien estar suplementados con azúcares adicionales en la formulación. Otros medios contienen productos químicos a una concentración conocida los cuales varían de acuerdo con las necesidades nutricionales de cada microorganismo en particular.

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Algunas casas proveen el abastecimiento de estos medios de cultivo para los laboratorios de microbiología. La forma en que se presentan estos medios de cultivo comerciales es como productos deshidratados, generalmente con un pH ajustado y en cuyo envase se indica la composición química del medio, así como la cantidad de gramos necesarios para reconstituirlo y las precauciones que se deben tomar en consideración durante su elaboración y esterilización.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

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1. MEDIOS NO SELECTIVOS.

Son ricos en nutrientes y comúnmente usados para enumerar microflora total o para transferir o mantener microorganismos purificados ej.

* Agar nutritivo

* Agar para métodos estándar

2. MEDIOS SELECTIVOS.

Permite el crecimiento de un tipo en particular de microorganismos y suprime el crecimiento de la flora competitiva, por medio de agentes selectivos apropiados que forman parte de la composición del medio ej.

* Agar papa dextrosa acidificado, agente selectivo = ácido tartárico

* Agar EMB (eosina y azul de metileno) colorante cristal violeta = agente selectivo

3. MEDIOS DIFERENCIALES.

Son utilizados para diferenciar poblaciones de microorganismos con base en una característica bioquímica ej.

* Agar bilis rojo violeta, para diferenciar microorganismos fermentadores y no   fermentadores de lactosa.

*  Agar Streptococcus – KF para diferenciar Enterococos fecales fermentadores de maltosa

4. MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES.

Contienen agentes que proveen una eficiente forma de de seleccionar y diferenciar microorganismos, cuando están presentes en una microflora mixta o compleja.

* Agar de sal y manitol

* Agar Baird Parker            

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Leer cuidadosamente las instrucciones indicadas para la preparación del medio indicadas en la etiqueta de los recipientes conteniendo los medios de cultivo.

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1. Utilizar agua destilada o des ionizada medida con una probeta.
2. Utilizar recipientes con el doble de capacidad en volumen de la cantidad que se va a preparar,  ya que durante el calentamiento para disolución, hervido y esterilización el medio se expande.
3. Pesar cuidadosamente la cantidad requerida, al medio de cultivo desecado que ha sido pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad de agua restante, para desprender e incorporar las partículas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a las paredes del recipiente.
4. Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina deben ser calentados y hervidos para obtener su disolución, la cual se obtiene cuando el medio se torna más transparente y se forman burbujas en la parte inferior del recipiente, durante el tiempo de calentamiento el matraz se debe estar agitando periódicamente para evitar que el medio se deposite en el fondo se caramelice y se queme o caramelice.

1. Una vez alcanzada la disolución los medio se retiran de la estufa ya que puede continuar hirviendo y derramarse. Es importante tomar en consideración lo siguiente:

• Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento.

Por este motivo, no deben calentarse más de lo estrictamente necesario.

1. Los medios nutritivos que no contienen agar-agar ni gelatina (caldos de cultivo) son soluble en agua fría o templada sin necesidad de calentamiento, solo se agitan para obtener una disolución homogénea.
2. Tapar los recipientes con tapones de algodón y protegerlos con papel Kimberly.
3. Someterlos a esterilización.

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ESTERILIZACION:

La esterilización se define como la eliminación de cualquier forma de vida patógena o inocua de un objeto o material.

Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave (olla de presión) hasta que se alcanza la temperatura de 121°C (presión de 15lb/in2) que se mantiene constante durante 15 minutos. La esterilidad solo se consigue con seguridad cuando se ha desalojado correctamente el aire de la cámara de vaporización de la  autoclave y de los recipientes en ella contenidos. Tras la esterilización y una vez que el manómetro marque 0, los medios de cultivo deben dejarse enfriar y almacenarse a temperatura ambiente o refrigeración o bien mantenerse en un baño maría a una temperatura de 50°C, para mantenerlos líquidos y poder ser utilizados en ese momento.

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