Medios y métodos de cultivo

MEDIOS Y MÉTODOS DE CULTIVO

GONZALEZ-MORALES, Ana María; ROA-GUTIERREZ, Nelcy Yurleiny.

Universidad de la Amazonia, Facultad de Ciencias Básicas, Programa Biología, Curso de Microbiología, sexto semestre, GA.

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son un conjunto de nutrientes, que tienen factores de crecimiento para crear las condiciones necesarias para el desarrollo de microorganismos. Esta diversidad metabólica es tan grande que la variedad de métodos de cultivo es enorme provocando que no exista un medio de cultivo universal para todos ellos, por eso, existen diferentes tipos de medio de cultivos que se encargan de proporcionar condiciones de crecimiento óptimas para tipos específicos de microorganismos, por ejemplo, los medios generales se encargan de permitir el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, también están los medios de enriquecimiento, ellos se encargan de favorecer el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo pero sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento de los demás, por otro lado, encontramos el medio selectivo, el cual permite el crecimiento determinado de un tipo de microorganismo pero éste si inhibe el crecimiento de los demás, y por último, los medios diferenciales son los que manifiestan las propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee.

La preparación de los medios de cultivo al variar ampliamente debido al tipo de microorganismo que se desea cultivar, es necesario conocer las necesidades nutricionales básicas del organismo a trabajar, por ello, los componentes mas habituales utilizados en los medios de cultivo es Agar, el cual se utiliza en los cultivos como un agente gelificante y es añadido cuando se busca un medio sólido o semisólido, también un cultivo de organismos patógenos necesita de fluidos corporales para que se puedan desarrollar como lo harían en su ambiente natural, por otro lado, se cuenta con extractos, que son obtenidos de diferentes partes de animales(carne, hígado) o también de vegetales(semillas) el cual es procesado para obtener un concentrado sólido como en forma de pasta o polvo, también contiene peptonas que son las que se encargan de otorgar proteínas y por último cuenta con amortiguadores el cual se encarga de evitar que se den los cambios bruscos en el PH y ayudan a mantener un rango optimo para que el organismo sea capaz de tolerarlo (BioCen, 2018).

PRE-LABORATORIO

Según su naturaleza química un medio de cultivo puede ser simple o compuesto, nutricionalmente mínimo o enriquecido y funcionalmente selectivo o diferencial, consulte las diferencias entre los diferentes medios de cultivos.

Cultivo solido: Contiene agar a concentración 1,5-2%, se pone en las placas de Petri. Se usa para aislar colonias o analizar las características de las colonias

Cultivo liquido: Tiene gran variedad de nutrientes y no tienen agentes gelificantes (viscosidad y mayor estructura)

Cultivo semisólido: Contiene agar al 0,5% o menos, su consistencia es como crema y su utilidad es en cultivos de microaerófilo o determinar motilidad.

Consultar cual es el mecanismo de acción de los antibióticos

Los mecanismos de acción son 5:

Inhibidores de la síntesis de la pared bacteriana: encontramos los beta- lactámicos, Penicilina, cefalosporinas, carbapenémicos, monobactámicos y otros como fosfomicina, cicloserina, bacitracina, vancomicina

Alteraciones en la membrana citoplasmática: Polimixinas y daptomicina.

Inhibición de la síntesis de proteínas: En la subunidad 50s encontramos: Estreptogranminas, cloranfenicol, lincosamidas, linezolid y macrólidos. En la subunidad 30s están: Tetraciclinas y aminoglucósidos.

Interferencia en la síntesis de ARN y ADN: Quinolonas, metronidazol y rifampicina.

Inhibición en las vías metabólicas: Sulfonamidas y trimetroprim.

METODOLIGÍA: Esta práctica de laboratorio se dividió en cinco fases: (Preparación de medios, valoración, siembra, identificación y resistencia). En la primera fase, la docente inicio la práctica con una explicación sobre los tipos de agar que son: Agar nutritivo, suelen ser granulados; Agar agar, se encuentran solidos o semisólidos y no agar agar estos son medios líquidos con menor concentración de agar. Posterior a esto, se realizó la preparación del medio agar nutritivo y para conocer la cantidad de gramos a utilizar se realizó la siguiente formula: 500ml*20g/1000 H2O= 10g que equivalen a la cantidad a utilizar para la preparación del medio, se debe obtener una mezcla homogénea y calentar, esto se llevó a la autoclave dejando por 15 minutos a 121°C, para finalizar se depositaron 18mls del preparado a cada caja de Petri.

En la segunda fase (valoración del cultivo), las cajas de Petri contaban con ausencia de artefactos, y se evaluó la productividad (capacidad para recuperar el microorganismo) y la selectividad (capacidad para inhibir el organismo no deseado). En esta fase los dos medios se llevaron sin nada a la incubadora para confirmar su esterilidad. Posterior a esto, se plasmó una línea vertical en las dos cajas de Petri con ayuda de asas estériles que contenía caldo de BHI y cinco estrías paralelas en cuatro cuadrantes, este mismo proceso se llevó a cabo con una caja de Petri que contenía E. coli. por último, se calculó el índice de crecimiento mediante la prueba ICA, el cual se calcula asignando 0,2 a cada estría y se multiplica por el número de estrías de los cuadrantes donde se presentó crecimiento y 1,0 en la estría central si presenta crecimiento. Un ejemplo de esto es: 5+2*0,2 = 1,4 + 1,0 de la estría central = 2,4 ICA.

Durante la tercera fase, se procedió a esterilizar el asa y tomar un inoculo del medio de cultivo transfiriéndolo a una caja de Petri con agar Mac-conkey, formando estrías en 4 cuadrantes, este procedimiento se repitió en una caja de Petri de Agar eosina azul de metileno (EMB) y en una caja de Petri con staphylococcus aureus; en este caso se realizó una línea horizontal y encima de ella una estría, se pusieron los medios de cultivos en una incubadora para observar su crecimiento.

En la cuarta fase, se utilizó una micro pipeta para adicionar los reactivos en la cúpula del test, en la prueba de glucosa de agregó reactivo TDA, el de indol y IND se adicionó reactivo James, en VP se agregó VP1.

Por último, en la quinta fase se manejó la cepa del antibiograma del grupo B. Se esterilizo el asa y se tomó el crecimiento de la colonia, se hizo la suspensión en la solución salina hasta que esta quedara turbia, después se introdujo un hisopo estéril y con él se realizó una siembra masiva en el medio de cultivo, esta debe de quedar muy tupida y con un ángulo de 90°. Se esperó hasta que se secara y con una pinza esterilizada se empujó y se agarró el sensidisco, se colocaron dos en direcciones contraías en el medio de cultivo y fueron llevados a la incubadora por un aproximado de 18 horas.

RESULTADOS:

La preparación del medio fue efectiva ya que no se presentaron inconvenientes al momento de prepararla y al verificar que tan estéril era,  fue satisfactorio el proceso, no se encontraron objetos dentro de la caja y contaron con un pH óptimo para el crecimiento bacteriano (ver img 1,2, 3,4 y 5) ; al momento de realizar el control de calidad del determinado producto se pudo observar que en caja de selectividad y en productividad no crecieron colonias a comparación de la caja que contenía E. Coli en donde crecieron colonias en las estrías de todos sus 4 cuadrantes y en la línea centra, la prueba indica que su ICA es de 5 puesto que estuvo la colonia presente en todas las estrías ( ver img 6,7 y 8); en cuanto a las siembra y aislamiento de cultivo se observó que en el cultivo de agar eosina azul de metileno al momento de crecer las colonias no afectaron el color como era lo esperado, porque no se tornó a un color verde, sin embargo, el agar siempre conservó su color actual. El aguar Mac- conkey E. Coli se tornaba de un color rosado oscuro y al momento que se realizó la siembra pasada las 24 horas se puedo evidenciar cómo ésta perdió el tono de color quedando de un color rosado oscuro (ver img 10 y 11).

El sistema API es un sistema estandarizado para Enterobacteriaceae y otras bacterias no fastidiosas gramnegativos en los cuales se usan 20 pruebas bioquímicas miniaturizadas, el principio consiste en 20 microtubos que contiene sustratos deshidratados inoculados con suspensión bacteriana. Durante la inoculación el metabolismo desarrolla un cambio de color con un nuevo reactivo. Al realizar la lectura del test nos damos cuanta cuáles son positivas y cuáles negativas: ONPG es positivo, ADH positivo, LDC negativo, ODC positivo, CIT positivo, H2S negativo Ure negativo, TDA negativo, IND negativo, VP positivo, Gel negativo, (Glu, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA) todas positivas. Cabe resaltar que en la prueba de VP se tenía que agregar VP1 y VP2, pero en el momento en el laboratorio solo se contaba con el reactivo VP1 lo que ocasionó que este no tuviera un color rosa fuerte si no que resultase un color rosa claro (ver img 12-13).

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