PRIMERA ETAPA AISLAMIENTO DE HONGOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS

PRACTICA 1. PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS

PRIMERA ETAPA AISLAMIENTO DE HONGOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS

INTRODUCCIÓN

La investigación de microorganismos productivos para la búsqueda de nuevos metabolitos microbianos requiere procedimientos altamente selectivos que permitan el aislamiento de organismos, que proporcionen nuevos metabolitos de potencial interés, a partir de una población de fondo extremadamente grande de microorganismos comunes que producen metabolitos conocidos o no deseados. En la mayor parte de los programas de búsqueda se seleccionan los microorganismos raros o delicados, ya que la probabilidad de descubrir actividades nuevas e interesantes en ellos es mayor; se utilizan ensayos altamente específicos, sensibles, diseñados para detectar actividades específicas a partir de un organismo que es difícil de aislar en la naturaleza. El enriquecimiento y la eventual selección de microorganismos poco comunes es difícil e implica una considerable técnica y trabajo laborioso para detectar y establecer características importantes. Los cultivos interesantes frecuentemente deben ser repurificados, debido a la presencia de organismos comensales de crecimiento más lento, y cuando se aislan de la naturaleza son inherentemente variables en sus características de crecimiento y actividades metabólicas. De ahí que una etapa fundamental en esta clave de búsqueda sea minimizar la variabilidad genética seleccionando aislados estables, genéticamente uniformes, que produzcan la mínima cantidad de metabolitos no deseados y grandes cantidades del componente que se desee 3.

En general, el motivo principal para el desarrollo industrial de cepas es el económico, ya que las concentraciones de metabolitos producidos por las cepas silvestres son muy variadas, de ahí que muchos sitios en este momento son objeto de búsqueda; tradicionalmente el suelo ha sido el nicho ecológico común, así como lodos de lagos y ríos; los intentos están orientados hacia ambientes extremos como  reservorios de especies microbianas, buscando nuevas cepas productoras de antibióticos para enfermedades diversas, características de espectro de acción y alto rendimiento 3.

A través de un extenso programa de desarrollo de cepas es posible superar los rendimientos demasiado bajos de las cepas silvestres, logrando conseguir así generalmente aumentos de producción de hasta 100 veces más. El éxito de estos programas depende principalmente de la sustancia y calidad que se quiere producir, así como de la posible optimización mediante técnicas de manejo genético.

Una característica común de las cepas silvestres, además de su bajo rendimiento, es que frecuentemente producen una mezcla de sustancias químicamente relacionadas; para un proceso rentable serán necesarias cepas con propiedades de fermentación mejorada, además con características de producción que sinteticen un compuesto como producto principal, haciendo posible un proceso de recuperación simplificado 2. Sin embargo, la búsqueda y el hallazgo de nuevas cepas microbianas está vigente, hay nuevos ambientes por explorar, nuevos espacios que descifrar y aprovechar, porque hay nuevas necesidades terapéuticas, nuevas aplicaciones, como agentes citostáticos, como estimuladores de crecimiento animal y medicina veterinaria, en el control de enfermedades de plantas; la importancia de la producción de los antibióticos para las cepas productoras es todavía de amplio estudio 4.

OBJETIVOS

Aprender de manera práctica y sencilla una forma de aislar hongos.

Adquirir conocimiento acerca de las técnicas que se utilizan para el muestreo y estudio de la selección de un microorganismo productor de antibiótico.

EQUIPO                                MATERIALES                                REACTIVOS

Balanza analítica                        Matraces Erlenmeyer de 250 mL                Pizeta con agua destiladas

Autoclave                        Caja Petri                                Agar Papa dextrosa o Saboraud

Estufa microbiológica                Termometro de 0 a 100 ºC                        

Campana de flujo laminar                Asa bacteriológica                        Agitador magnético

Parrilla de calentamiento                Espátula                                        Papel destraza

                                Mechero                                 

                                Gasa y algodón                                

METODOLOGÍA

1. Pesar la cantidad indicada de agar (revisar el frasco). y disolver en un matraz Erlenmeyer con agua destilada. Realizar el cálculo necesario si no se desea preparar un litro.
2. En una probeta, medir la cantidad de agua destilada para el número de cajas a preparar, considerando 20 mL de medio por caja.
3. Colocar la cantidad de medio pesada, en un matraz Erlenmeyer. Disolver el medio con el agua destilada medida en la probeta.
4. En una parrilla, hervir el medio por un minuto.
5. Esterilizar en autoclave y dejar enfriar, aproximadamente a 50 °C.
6. En condiciones estériles, llenar las cajas de Petri con 20 ml de agar. Dejar solidificar.
7. Tomar muestras de hongos a partir de jitomate, tortilla o pan. Tomar los hongos que presenten coloración verde o verde azulada.
8. Realizar observaciones macro y microscópicas.
9. Macroscópicas (color, forma, tamaño y textura del crecimiento).
10. Microscópicas (cuerpos fructíferos, esporas, tinción Gram). Si las características corresponden al Género Penicillium y/o Aspergillus continuar la práctica (este paso puede realizarse después de haber sembrado el hongo).
11. Sembrar las cajas por estriado continuo para obtener buena cantidad del hongo.
12. Etiquetar las cajas y poner a incubar a 28°C durante 2 a 3 días. Revisar la temperatura de la incubadora durante el tiempo de incubación.
13. Observar diariamente el crecimiento

RESULTADOS

1. Observar el crecimiento de las colonias de hongos. En el caso de Penicillium aparecerán colonias de 1 a 3 mm de tamaño, verdes (sólidas y redondas) y con olor a tierra en las placas.

2. Anotar las características de las colonias, tamaño, forma y color.

3. Observar si hay predominio de un tipo determinado de colonia.

4. Revisar si hay colonias de un color diferente al anteriormente mencionado.

CUESTIONARIO

1. Taxonómicamente ¿Qué son los Deuteromicetos?
2. En el laboratorio ¿Qué características y condiciones tiene que haber para que prolifere Streptomyces y Penicillium?
3. ¿Qué es un antibiótico aminoglicósido?

4)  Anota el tipo de hifas y esporas que presenta Penicillum y Aspergillus

REFERENCIAS

1. Apuntes del Curso de Microbiología Industrial. 1987. Laboratorio de Microbiología, IPN.
2. Apuntes del Curso de Microbiología Industrial II. 1987. Laboratorio de Microbiología, IPN.
3. Bu’lock J. 1992. Biotecnología Básica. 3a Edición. Editorial Acribia. Zaragoza, España.
4. Crueger Wulf, C. Anneliese. 1989. Manual de Microbiología Industrial. 3a Edición. Editorial Acribia. Zaragoza, España.
5. Jagnow Gerhard, Wolfgang Dawid. 1991. Biotecnología con experimentos modelo. 3a Edición. Editorial Acribia. Zaragoza, España.

PRACTICA 1. PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS

SEGUNDA ETAPA PRODUCCIÓN DEL ANTIBIÓTICO POR FERMENTACION SUMERGIDA

INTRODUCCIÓN

Los  conceptos de la quimioterapia antibacteriana que se manejan  actualmente han existido por no más de cincuenta años; los antecedentes históricos de los antibacterianos que ocurren en forma natural (los antibióticos), también corresponden a observaciones hechas durante el siglo pasado. En 1871, J. Burdon Sanderson demostró la inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de un hongo contaminante del género Penicillium, y en 1884 Joseph Lister logra el tratamiento exitoso de un absceso en un individuo mediante la aplicación local del sobrenadante de un cultivo en caldo de Penicillium glaucum 6. A partir de ese momento diversos investigadores se dieron a la tarea de seguir estudiando las propiedades antibióticas de los hongos y en 1929 Alexander Fleming publica sus observaciones sobre la actividad de una especie de Penicillium (P. notatum), basado en lo que sucede cuando una colonia contaminante de hongos en un cultivo en caja de Petri provocó la lisis de algunas colonias de Staphylococcus que se encontraban creciendo en agar 8; esta observación inició el desarrollo de muchos otros antibióticos. El uso de la penicilina tuvo sin embargo que esperar hasta 1944-1945 debido a la necesidad de desarrollar métodos de aislamiento  y purificación, así como su crecimiento a gran escala 6,8. El aislamiento fue resuelto por un grupo dirigido por Florey, quienes reemplazaron las botellas usadas inicialmente para el cultivo de Penicillium por biorreactores 8.

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