PRÁCTICA 5. AISLAMIENTO DE BACTERIAS FERMENTATIVAS: RUTAS DE PRODUCCION DE ACIDOS MIXTOS Y DE 2,3-BUTANODIOL

PRÁCTICA 5. AISLAMIENTO DE BACTERIAS FERMENTATIVAS: RUTAS DE PRODUCCION DE ACIDOS MIXTOS Y DE 2,3-BUTANODIOL

*Estudiante de Microbiología Industrial y Ambiental, Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

OBJETIVO:

Aislar bacterias de la familia Enterobacteriaceae a partir de una muestra de suelo e identificar ruta fermentativa a partir de pruebas metabólicas y análisis de resultados.

RESULTADOS Y ANALISIS:

Figura 1

Luego de haber diluido la muestra e inoculado en agar MacConkey después de 24 horas a 35°C se observaron colonias con diversa morfología: colonias rojas brillantes, circulares con elevación convexa y bordes enteros, colonias de color rosado de forma circular, elevación convexa y elevación ondulada; resultados esperados ya que por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares (Figura1). Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras (1)

Se aíslan en agar nutritivo (Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento y recuento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales), 4 colonias de color rojizo por medio de la técnica de agotamiento, se incuba a 35°C por 24 horas.

Figura 2

Se obtuvieron colonias de color crema con forma circular, elevación convexa y bordes ondulados los cuales se procede a realizar tinción de Gram esta permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción (Figura 2). El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. (2)

Al Gram se observaron bacilos Gram (-), lo que nos dirige a realizar prueba de oxidasa.

La prueba de oxidasa se utiliza para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa (3).

La prueba de oxidasa fue negativa para las 4 diferentes colonias aisladas, por lo tanto se seleccionaron las 2 mejores colonias morfológicamente para realizar la prueba de OF.

Figura 3:

OF: Medio de cultivo, que al ser suplementado con hidratos de carbono, se usa para determinar el metabolismo oxidativo-fermentativo de las bacterias Gram negativas. Esta prueba es útil para diferenciar especies bacterianas. También, permite determinar movilidad y producción de gas.

En el medio de cultivo, contiene una alta concentración de un hidrato de carbono, el cual hace que los microorganismos lo utilicen para su desarrollo, evitando que bacterias aeróbicas utilicen la tripteína presente con la consecuente producción de reacción alcalina, la que se neutraliza por la ligera acidez producida por un microoganismo oxidativo.

El fosfato dipotásico agrega capacidad reguladora, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo en medio ácido. La glucosa es el hidrato de carbono más frecuente que se agrega al medio

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