Paper "Origen procariotico de la actina del citoesqueleto"

Origen procariótico de la actina del citoesqueleto

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Se pensaba hasta hace poco que las bacterias carecen de actina o redes de filamento de tubulina que organizan el citoplasma eucariota. Sin embargo, aquí mostramos que la proteína bacteriana MreB se ensambla en filamentos con una subunidad de repetición similar a la de F-actina -  el polímero fisiológico de la actina eucariota. Elucidando  la estructura cristalina MreB demostramos que MreB y la actina son muy similares en tres dimensiones. Por otra parte, los cristales contienen protofilamentos, lo que permite la visualización de filamentos similares al de actina en resolución atómica. La estructura del protofilamento MreB está en muy buen acuerdo con el modelo de F-actina, lo que demuestra que las proteínas se ensamblan en orientaciones idénticas. Las propiedades similares a la actina de MreB explican el hallazgo de MreB en una amplia forma fibrosa de espirales debajo de la membrana celular de las células en forma de varilla. Donde están involucrados en determinación en forma de células, por lo tanto, ahora se sabe que las procariotas poseen homólogos tanto de la tubulina, llamado FtsZ, y de actina.

Un componente central del citoesqueleto eucariota es la actina filamentosa. La actina es la proteína más abundante en varias células eucariotas, y se conserva desde la levadura a los seres humanos. En 1942, Straub aisló actina monomérica (actina G) y descubrió que el aumento de la concentración de sal causa que la actina G se polimerice en actina filamentosa (actina F), La microscopía electrónica y difracción de rayos X de fibra han mostrado que la actina F consiste en dos protofilamentos que están torcidos suavemente alrededor del otro para formar una doble hélice dextrógira. Las subunidades en cada protofilamento de actina tiene aproximadamente 55 espacios A, y el paso helicoidal es variable debido a la flexibilidad de torsión de los protofilamentos, Bajo condiciones apropiadas, la actina se polimerizara en una variedad de polímeros. Cuando la actina es tratada con gadolinio, se ensambla en láminas y cilindros de protofilamentos rectos. Los polímeros filamentosos de actina determinan la forma de muchas células eucarióticas, además de tener una amplia gama de otras funciones. La estructura tridimensional de la actina G, que tiene una masa molecular relativa de 43.000 (Mr 43K), ha sido determinada en complejos en varias proteínas obligatorias de actina que previenen la polimerización de actina.

La actina es un miembro de una superfamilia más grande de proteínas, que incluye Hsp70 (ref. 13), la proteína de división celular FtsA, y quinasas de azúcar. Las estructuras cristalinas han revelado que cada miembro de la superfamilia de la actina tiene el característico núcleo de la actina, y es distinguido por inserciones o supresiones adicionales que son necesarios para la función específica de cada miembro de la familia. Una secuencia de investigaciones  de datos reveló que las proteínas bacterianas MreB y STBA tienen patrones de secuencia en común con la superfamilia de actina.

MreB, entre todas las proteínas de la superfamilia, está estrechamente más relacionada a la actina en tamaño global.

El gen MreB se encuentra en el grupo de genes MRE (grupo mureína e), Es, junto con MRD, el operón principal involucrado en la determinación de la forma celular en las bacterias. Evidencias recientes muestran que MreB se ensambla a una estructura similar a la del citoesqueleto como en Bacillus subtilis. MreB y la proteína estrechamente relacionada Mbl son importantes en la regulación de la forma de la célula de B. subtilis ; inmunofluorescencia revela que alargados polímeros de MreB y Mbl rodean la célula como grandes espirales bajo la membrana de esta. Las proteínas de MreB son ampliamente distribuidas entre bacterias con forma de varilla, filamentosa y helicoidal, lo que sugiere que un citoesqueleto MreB es importante para generar una forma no esférica.

Para investigar si MreB puede auto ensamblarse en filamentos similares a la actina, clonamos y purificamos MreB de Thermotoga marítima.

Análisis bioquímicos y con microscopios de electrones  han mostrado que las proteínas forman filamentos con repeticiones longitudinales similares a los de la actina eucariota. La elucidación de la estructura cristalina de MreB muestra que sin duda está claramente relacionada a la actina. Además, el empaquetamiento cristalino revela la estructura filamentosa de una proteína similar a las actina a resolución atómica. Aquí proporcionamos evidencia química y estructural para MreB como el homólogo de la actina bacteriana.

Ensayos de polimerización

El gen que codifica MreB1 de t marítima fue amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa y clonada por sobreexpresión en tensión de la Escherichia coli C41 (ver métodos).

La thermoga marítima tiene 2 genes MreB. También clonamos MreB2, pero la proteína era mayormente insoluble (datos no mostrados).

Una explosión de búsqueda con ambas proteínas reveló que MreB1 está más estrechamente relacionada a MreB de b subtitilis, con 56% de identidad global.

MreB forma polímeros bajo varias condiciones, como fue investigado inicialmente en un ensayo de granulación (fig. 1)

Para polimerizar, MreB requiere ATP (fig. 1a, carril 1) o GTP (carril 5). Este puede formar filamentos en ausencia de magnesio (carril 4).

Los polímeros se forman en un amplio intervalo de pH, el óptimo es de 6-7 (fig. 1b). En contraste con la polimerización de actina, la cual requiere concentraciones fisiológicas de sal, la t marítima MreB es capaz de formar filamentos a través de un amplio intervalo de concentración salina, tan alta como 4 m de NaCl.

El hecho de que los organismos termófilos usualmente posean alta relatividad de concentraciones salinas intracelulares podría explicar la habilidad de la t marítima MreB de reunirse en alta sal.

La microscopía electrónica

La naturaleza de los polímeros MreB, que se encuentra en el ensayo de granulación, fue investigada por microscopía electrónica de muestras teñidas negativamente. La variedad de polímeros formados en diferentes condiciones (véase la Fig. 2a, e). Los polímeros más simples son filamentos delgados que parecen consistir en dos protofilamentos (cada uno compuesto de una cadena de monómeros), pero dichos filamentos delgados individuales son poco frecuentes. Más comunes son los pares de filamentos delgados, que son a menudo curvados (Fig. 2a) en función de la condiciones utilizadas. Los que se muestran en la Fig. 2a son altamente curvados  de lo que se requiere para producir los filamentos curvos observado in vivo. A partir de nuestras imágenes no está claro cómo la curvatura está alojada en la estructura.

La imagen filtrada (Fig. 2d) del polímero en la Fig. 2b (diámetro de aproximadamente 160A e) aparentemente muestra dos filamentos delgados, con una separación de aproximadamente 51A Ê longitudinal (Fig. 2c). Los filamentos delgados parecen carecer el giro distinto de los dos varados-hélices de Factin, aunque a menudo parecen tener un ligero giro. A bajas concentraciones de NaCl (25 mM NaCl), MreB forma láminas cristalinas de dos dimensiones (Fig.2e).

[pic 1]

Figura 1 Ensayos de polimerización MreB. MreB se incubó a

37 ° C con nucleótidos y NaCl, y se centrifugó a 140,000g. S, sobrenadante; P, pellet solubilizado. Proteínas se separaron en un gel de SDS 12% y se tiñeron con la página 83. a, Efecto de nucleótidos y del magnesio. MreB requiere ATP o GTP, pero no magnesio, para la polimerización. b, pH óptimo. MreB se incubó bajo condiciones estándar (ver Métodos) con tampón amortiguador de 100 mM: citrato de pH 4, pH 5, MES pH 6, HEPES pH 7, Tris-HCl pH 8, bicina pH 9. Granulación máxima se observó a pH 6 ± 7.

El patrón de difracción de las láminas también muestra una fuerte línea de capa en 51A E, y, además, una separación de 39A E en el plano ecuatorial (Fig. 2f). Imágenes filtradas de las láminas (Fig. 2g) muestran filamentos individuales que son consistentes con las de los protofilamentos en la estructura cristalina (véase más adelante). Ellos parecen estar relacionados a las láminas de gadolinio de actina inducido, que consisten en protofilamentos no trenzados dispuestos en una conformación antiparalela. Es posible, pero aún no determinado, que las láminas MreB también tiengan una disposición antiparalela de protofilamentos.

[pic 2]

Figura 2 Las micrografías electrónicas de filamentos MreB manchadas negativamente. a.Vista típica de filamentos MreB cuando se utiliza sal y pH neutro. Se incubó MreB (1 mg ml-1)  durante 30 min a 37°C en 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl,  3 mM de CaCl2, 2 mM ATP (protegido) y 4 mM MgCl2. Barra de escala, 100 nm. El filamento indicado con una fleche es el mismo filamento que se muestra con un aumento mayor en b.

b. `Doble' filamento formado en pH alto. Se incubó MreB (1 mg ml-1) durante 30 min a 37°C en 100 mM BICINE, pH 9.0, 100 mM NaCl, 2 mM ATP protegido) y 4 mM MgCl2. Barra de escala, 100 nm. c. La imagen de difracción del polímero en b muestra la primera línea de capa fuerte en 51 A. d. La imagen filtrada de b, trata ambos filamentos por separado. El polímero tiene cerca de 160 A de amplitud, lo que sugiere que son solo cuatro filamentos en total (cada 40 A, ver Fig. 5).  e. La micrografía electrónica de una hoja MreB manchada negativamente. MreB (1 mg ml-1) se incubó durante 30 min a 37°C en 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM de NaCl, 2 mM ATP (protegido) y 4 mM MgCl2. Los protofilamentos se alinean verticalmente en las hojas MreB. Barra de escala, 100 nm. f. Imagen de la difracción de la hoja en e. La repetición longitudinal es 51 A, la separación lateral es 39 A.  g. Imagen filtrada de la hoja en e. h. Los protofilamentos encontrados en los cristales de MreB encajan bien con la imagen filtrada en g. La repetición longitudinal de 51 A en las hojas es igual que en los cristales (Fig. 5). La separación lateral en las láminas sugiere que los protofilamentos interactúan con sus lados planos.

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