Practica 2: Perdida del potencial de membrana mitocondrial y producción de ROS por citometría e flujo

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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Unidad de Aprendizaje:   Biología Celular

Practica 2: Perdida del potencial de membrana mitocondrial y producción de ROS por citometría e flujo

Programa Educativo: (Carrera) Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Grupo: 252

Equipo 5º

Alumnos: (Nombres)

1616505 Castillo Luna José Alfredo

1662143 Contreras Puente Rogelio

1677923 Moreno Garza Adrián Marín

1657345 Olalde Garza Esther Andrea

1665168 Orta Reyna Zabdiel Isachar

Profesor (a): PhD. Ana Carolina Martínez Torres

Fecha: 18/10/2017 

Practica 2: Perdida de potencial de membrana mitocondrial y producción de ROS por citometría de flujo

Introducción

La energía que se obtiene a través de la transferencia de electrones a lo largo de la cadena transportadora es usada para bombear protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembranal, creando un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna (ΔΨm: potencial de membrana mitocondrial). Este gradiente de protones permite a la ATP sintasa utilizar el flujo de H+ generados para producir ATP a partir de adenosina difosfato (ADP) y fosfato inorgánico. De esta manera, la membrana mitocondrial interna separados compartimientos de diferente concentración de H+, lo que produce diferencias en la concentración química (ΔpH) y en la distribución de la carga (ΔΨm) a través de la membrana. El resultado neto es la fuerza protón motriz (ΔG) (Grimm & Brdiczka, 2007).

Por ejemplo, en neuronas, la regulación del potencial de la membrana interna de la mitocondria está dada, en parte, por la vía PI3K/Akt. Se ha demostrado que la activación de Akt, promueve la supervivencia celular neuronal por la activación de factores de crecimiento que actúan contra varios estímulos apoptóticos a través de la modulación de la actividad de la proteína Bcl-2 en las neuronas y de Bcl-xL en células de Schwann, ya que regulan la actividad del poro de permeabilidad transicional de la mitocondria e impiden la liberación de proteínas apoptóticas. Además, los blancos de señalización de PI3K favorecen la transcripción de genes como CREB y el factor nuclear κB (NF-κB), que codifican para proteínas antiapoptóticas (Lodish, 2006).

Recientemente se ha demostrado que un método eficaz para medir el potencial de membrana es mediante la citometría de flujo. La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión. El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora (Shapiro, 2003).

Metodología

• En placas se tienen las células CEM, un control, y un tratamiento de IMATINIB a diferentes concentraciones (5, 10 y 20 uM) y otro control con Imunepotem. (3-4 repeticiones).
• Se toman 100 uL con micro pipeta a viales (se utiliza PBS para toma completa de células).
• Centrifugar 10 min (1600 revoluciones)
• Se elimina el sobrenadante con una bomba de vacío hasta que solo queden las células de la parte inferior
• Se marcan las células con TMRE añadiendo 50 uL a los viales
• Se colocan los viales en la incubadora (15- 30 min)
• Se centrifuga y se retira el sobrenadante
• Se les añade PBS y se llevan al clitómetro

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Diagrama de flujo [pic 4]

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Resultados

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Figura 1. Cuadruplicados que representan las gráficas obtenidas mediante el análisis de pérdida del potencial de membrana mitocondrial. El control son células sin un tratamiento previamente aplicado, mientras 5,10 y 20 uM son las diferentes concentraciones para las células tratadas con Imatinib por 48 horas y las ETO con células tratadas con etopósido (quimioterapia utilizada en algunos casos de leucemia) a concentración de 10uM por 24 horas. Mediante la observación de las gráficas de morfología se detectaron los distintos grados de complejidad de los eventos que suceden en la mitocondria y también se utilizó el éster etílico tetrametilrodamina (TMRE) es un tinte catiónico fluorescente de color rojo-anaranjado que penetra en la célula que las mitocondrias activas secuestran con facilidad por su carga positiva, se acumula fácilmente en mitocondrias activas debido a su carga negativa relativa. Las mitocondrias despolarizadas o inactivas tienen un potencial de membrana disminuido y no secuestran TMRE. Al observar ambas líneas celulares observamos que en el caso de K562 desde un principio se observan 2 morfologías distintas además que mediante TMRE se observar una mayor actividad por ambas partes con una concentración de 10 uM de Imatinib mientras que en ETO, 5uM de Imatinib y el control hay una baja cantidad de mitocondrias activas; por el otro lado, en la línea celular CEM solo se observa una morfología colonial en el control y en todos los tratamientos con Imatinib y se observa una alta presencia de mitocondrias activas, sin embargo, en el tratamiento con ETO se observa una morfología nueva que presenta una mayor cantidad de mitocondrias activas que las que estaban en un primer lugar. Nota: Eje X, tamaño de las mitocondrias activas o Forward Scatter α Size; eje y: Granularidad, complejidad o su Slide Scatter α Complexity.

Discusión

1790553 Aguilar Vázquez David Salvador

Mediante la aplicación de Imatinib en conjunto con proteínas que lo liguen a las células se han obtenido valores aceptables de inhibición del crecimiento sobre la línea K-562 de leucemia mieloide aguda. Por otro lado, se ha querido comprobar si estos compuestos ejercen su efecto a través de la inducción de apoptosis y del arresto del ciclo celular en alguna de sus fases. Para ello, se ha probado el compuesto MD-35 sobre la línea CCRF-CEM de leucemia linfoblástica aguda de células t. No se ha podido demostrar ni la inducción de apoptosis ni el arresto del ciclo, no obteniéndose diferencias estadísticamente significativas entre las células tratadas y el cultivo control (Cascales, 2003). Esto concuerda con lo elaborado en la práctica, realmente no se aprecia una pérdida significativa del potencial de membrana mitocondrial si nos basamos meramente en lo observado en las gráficas. Se observar un efecto muy similar para las distintas concentraciones de Imatinib y para ETO.

Se han identificado ambas líneas como posibles agentes responsables de la aceleración del proceso de apoptosis al inducirse en ratones. Por lo cual la pérdida del potencial de membrana se ve fuertemente ligado con este proceso, al ser insuficiente la carga en mitocondrias estas pueden llevar a la célula a morir por apoptosis o incluso a realizar el proceso de autofagia (Ibanez et al., 2011). Se observó que al tratar las dos líneas celulares hay diferencias significativas entre la actividad de la membrana mitocondrial que hay en la línea CEM y la línea K-562, esto se puede deber a 2 motivos principales, la agresividad del tipo de cáncer que se esté tratando, ya que uno puede proliferar más rápido así como también se puede deber a una mayor producción de ROS, de ser por esto bien se podría identificar con la tinción por DCFDA, el cual es un tinte fluorogénico que mide la actividad hidroxilo, peroxilo y otras especies de oxígeno reactivo (ROS) dentro de la célula. Después de la difusión en la célula, DCFDA / H2DCFDA se desacetila mediante esterasas celulares a un compuesto no fluorescente, que luego se oxida con ROS en 2 ', 7' - diclorofluoresceína (DCF). El DCF es un compuesto altamente fluorescente que puede detectarse mediante espectroscopía de fluorescencia con espectros de excitación y emisión máximos de 495 nm y 529 nm, respectivamente (Yang et al, 2017).  El detectar la actividad de ROS puede ser importante para el tratamiento de diferentes tipos de leucemia ya que puede ayudar a buscar métodos que reduzcan su producción y así evitar dirigir a las células hacia la apoptosis acelerada, debida a la metástasis de células cancerígenas.

1616505 Castillo Luna José Alfredo

1662143 Contreras Puente Rogelio

Se realizó una citometria de flujo a células de la línea celular K562 en la que se mostró una amplia efectividad conforme se agregaban más µM de IMATINIB y una casi nula efectividad en células tratadas con etopósido (quimioterapia utilizada en algunos tipos de leucemia) 10 µM por 24hrs, se observó cómo entre más alta era la concentración del tratamiento con IMATINIB, menor era la diferencia entre morfología así como la complejidad del evento (número de células) y al observar mediante luz ultravioleta estas células marcadas con TMRE un marcador específico para mito contra se observó una disminución en mitocondrias activas apoyando lo mencionado por Monzón (2007) que menciona que la respuesta citogenética en células de leucemia es alta, mientras que en las células CEM se notó una mayor efectividad en el tratamiento con etopósido y un aumento en la actividad con el IMATINIB ya que este tiende a ignorar estas células por lo que se aumenta el recuento de glóbulos blancos (en el que se incluyen las CEM).

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