Protocolo De E. Coli

Introducción

La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas.

La insulina interviene en el aprovechamiento metabólico de los nutrientes, sobre todo con el anabolismo de los carbohidratos. Su déficit provoca la diabetes mellitus y su exceso provoca hiperinsulinismo con hipoglucemia.

La síntesis de la insulina pasa por una serie de etapas. Primero la preproinsulina es creada por un ribosoma en el retículo endoplasmático rugoso (RER), que pasa a ser (cuando pierde su secuencia señal) proinsulina. Esta es importada al aparato de Golgi, donde se modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante puentes disulfuro.

Gran número de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva, bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo 1 y la diabetes tipo 2, incluso desde el primer día del diagnóstico.

La insulina es una hormona "anabólica" por excelencia: permite disponer a las células del aporte necesario de glucosa para los procesos de síntesis con gasto de energía. De esta glucosa, mediante glucólisis y respiración celular se obtendrá la energía necesaria en forma de ATP. Su función es la de favorecer la incorporación de glucosa de la sangre hacia las células: actúa siendo la insulina liberada por las células beta del páncreas cuando el nivel de glucosa en sangre es alto. El glucagón, al contrario, actúa cuando el nivel de glucosa disminuye y es entonces liberado a la sangre. Por su parte, la Somatostatina, es la hormona encargada de regular la producción y liberación tanto de glucagón como de insulina. La insulina se produce en el Páncreas en los "Islotes de Langerhans", mediante unas células llamadas Beta.

La insulina tiene una importante función reguladora sobre el metabolismo, sobre el que tiene los siguientes efectos:

• Estimula la gluconeogénesis.

• Inhibe la gluconeogénesis y la glucogenolisis.

• Promueve la glucólisis.

• Favorece la síntesis de triacilgleceroles (triglicéridos). Para ello, estimula la producción de acetil-CoA (por ejemplo, al acelerar la glucólisis), y también estimula la síntesis de ácidos grasos (componentes de los triacilgliceroles) a partir de la acetil-CoA.

• Estimula la síntesis de proteínas.

La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la célula, y la molécula de ADN ha pasado a ser mu simple de estudiar. Desde el año 1953, cuando Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN se han obtenido innumerables avances en el campo de la biología molecular y se han desarrollado muchas técnicas genéticas sofisticadas. La construcción de moléculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones genéticas por medios bioquímicos. El proceso también se denomina clonación molecular o clonación genética, porque se pueden propagar en una estirpe de organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y al crecer la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella. Para clonar (multiplicar) un fragmento de ADN se requiere de los siguientes pasos:

1. Obtener el fragmento de ADN que se pretende clonar.

2. Obtener y purificar el Vector de Clonado.

3. Digerir y ligar las moléculas de ADN (foráneo y vector) de tal manera que nos permita crear la molécula recombinante. Las reacciones de corte y ligación utilizadas deben poder ser comprobadas fácilmente por el uso de electroforesis en gel.

4. Introducir la construcción obtenida en el organismo hospedador adecuado (bacterias, levaduras, células de insecto, otros sistemas eucarioticos)

5. Crecimiento y selección de los organismos portadores de la molécula recombinante.

6. Obtener y purificar la nueva molécula de ADN.

Objetivos

Objetivo general:

• Obtener insulina humana haciendo uso de ADN recombinante en la bacteria E. coli.

Objetivos específicos:

• Realizar la extracción del ADN.

• Realizar una PCR estándar.

• Realizar una electroforesis.

• Realizar la inserción de la insulina en el plásmido pBR322.

• Preparar las células competentes de Escherichia coli.

• Inserción del plásmido pBR322 a Escherichia coli.

Problemática

En la actualidad podemos encontrar muchos casos de personas que padecen la diabetes desde niños hasta personas adultas, esto se debe a la baja concentración de glucosa en la sangre, la glucosa es la encargada de la estimulación de varias proteínas y ácidos grasos, todo se esta realizando con un fin para el ser humano que obtenga este producto a bajos precios y con mayor eficiencia, porque hoy en día este producto tiene un elevado costo y el efecto es poco por eso estamos buscando es una forma de producir insulina mediante el uso de ADN recombinante.

Algunos de los síntomas de la diabetes incluyen:

• Orina frecuente

• Sed constante

• Hambre excesiva

• Pérdida de peso inexplicable

• Aumento de fatiga y debilidad

• Irritabilidad

• Visión borrosa

METODOLOGÍA:

Extracción del ADN sanguíneo

Las muestras de sangre fueron recogidas de los pacientes con diabetes en tubos de EDTA (tapón malva) y posteriormente el ADN fue extraído mediante el kit de promega WIZARD® GENOMIC DNA PURIFICATION KIT. Para ello en muestro casa se utilizo un volumen de 300 µl.

a) Lisis de los glóbulos rojos

A los 300 µl de muestra se añaden 900 µl de Cell lysis solution mezclando por inversión a temperatura ambiente durante 10 minutos aproximadamente y golpearlo frecuentemente con los dedos para facilitar el desprendimiento de las células.

Posteriormente se centrifuga a 12000 rpm durante 2 minutos, se retira el sobrenadante dejando el pellet (y un pequeño volumen residual aproximadamente de 50 µl) que se vortea.

b) Lisis del núcleo y precipitación de las proteínas

Se añaden ahora 300 µl de nuclei lysis solution mezclando por inversión y se resuspende ayudándose de una pipeta.

Posteriormente se añaden 100 µl de protein precipitación solution y vortea. Se centrifuga a 12000 rpm durante 3 minutos.

c) Precipitación del ADN y rehidratación

Se pasa el sobrenadante a un nuevo tuvo y se añaden 300 µl de isopropanol mezclando por inversión hasta que se hace visible el ovillo de ADN.

Se centrifuga 4 minutos a 12000 rpm y se retira posteriormente el isopropanol.

Finalmente se añaden 300 µl de etanol al 70% y se centrifuga nuevamente 4 minutos a 12000 rpm. Se retira el etanol y se deja secar el pellet al aire con el tubo entre 10 y 15 minutos.

Por ultimo se añaden 100 µl de DNA rehydratation solution y se deja una hora en un baño con agitación a 65 °C resuspendiendo cada 10 minutos el ADN manualmente.

PCR estándar para identificar el gen de la insulina

Se realiza esta PCR para identificar el gen de la insulina y así poderlo insertarlo en el la E. coli, para esto se necesitan los siguientes reactivos para llevarla a cavo con sus respectivas concentraciones:

Ingredientes Concentraciones

dNTPs 100 µM

Magnesio 25 a 50 mM

Primer 25 a 50 mM

Taq polimerasa 5 unidad/ µl

Agua La cantidad necesaria para completar el volumen

DNA molde 100 ng

Los cebadores son de unas 20 bases. Tenemos dos cebadores; primers 1 y primers 2. Cada uno es específico y complementario a una secuencia de una de las cadenas

Primers 1 es específico para la secuencia adyacente al extremo 3´ de la zona a replicar en una de las cadenas. Acota al gen diana por su secuencia complementaria en el extremo 3´.

Primers 2 es específico para la secuencia adyacente al extremo 3´de la zona a replicar en la otra cadena. Acota al gen diana en el extremo 3´.

• Primer foward es: AGCCTTTGTGAACCAACACC.

• Primers reverse es: GCTGGTAGAGGGAGCAGATG.

Secuencia del gen de la insulina

AGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGGGCTCAGGATTCCAGGGTGGCTGGACCCCAGGCCCCATGAAGCATGTGGGGGTGAGCCCAGGGGCCCCAAGGCAGCTGTCTCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACGCAGGGTGAGCCAACTGCCCATTGCTGCCCCTGGCCGCCCAGCATGGGCAGAAGGGGGCAGGAGGCTGCCACCCAGTTCTCTTGGTCACGTCCTAAAAGTGACCAGCTCCCTGTTTGGCTTCGGCAGCCCCGAGATACATCAGAGGGTGGGCTGCCCCGCAGCCCATTTCTCCACCCTCATTTGATGACCGGGTGACCTGGGGTCACAGGGTGCCCCACGCTGCCTGCGGGCGTGGCTGCCTGCCTGAGTGGGCCAGACCCCTGTCATGGGGAAGATGCTGGGGACAGGCCCTGGGGAGAAGTAGCTGCCCCGGGGCGGGGGAAGGAGGTGGGACATGTGGGGTGACCCTCCCTCTAACCTGGGTCCAGCCCGGCTGGAGAGGCGGGCACTGTGTCTCCCTGACTGTGTCCTCCTGTGTCTGCGCGGCACGTCCTGGCAGTGGGGCAGGTGGAGCTCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGC

En la PCR se utilizan diferentes temperaturas para llevarla a cavo se podría decir que es un juego de temperaturas para llevar a cavo la amplificación.

1. Se realiza primero una desnaturalización a una temperatura de 95 °C con una duración de 2-5 minutos.

2. Se realiza otra desnaturalización con una temperatura de 95 °C con una duración de 30 segundos.

3. Se realiza el alineamiento con una temperatura media de aproximadamente 60

...