Curva De Crecimiento E. Coli

Objetivos

 Comprender, a través de métodos directos, el crecimiento microbiano de la Escherichia coli.

 Efectuar una correlación entre métodos de cuantificación.

 Calcular velocidad y tiempo de crecimiento celular, mediante la comparación de métodos.

Resumen

La finalidad de este laboratorio es dar cuenta de la cantidad celular (o población) existente en una muestra de Escherichia coli, la cual resulta ser uno de los organismo procariota más estudiado por el ser humano, ya que suele ser muy perjudicial para la salud. Pero para este caso, se tomaron en consideración muestras directas de cuantificación microbiana, para así identificar el crecimiento de células, y la velocidad y tiempos que estos demoran en calibrar (Turbidimetria y conteo microscópico).

Introducción

A través de este laboratorio, se requiere llegar a dos grandes puntos de encuentro. Por un lado, está la unidad de muestra o de análisis que se desea estudiar, por otro lado, es de suma importancia saber de qué manera se cuantificará dicha muestra, según los distintos procedimientos que se desean abarcar o llevar a cabo.

La muestra o unidad de análisis que se estudiará en este laboratorio es la Escherichia coli, y es quizá el organismo procariota más estudiado por el ser humano. De éste podemos decir, que se encuentra por lo general, alojado en los intestinos de los animales y, además, en aguas negras. La Escherichia coli, como patógeno, puede causar infecciones intestinales y extra intestinales como la infección al aparato excretor, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía, siendo muy dañina y/o peligrosa para la salud humana.

En lo que respecta a la instrumentación y métodos procedimentales, se mencionó el de cuantificación de microorganismos el cual permite identificar la población total de microorganismos existentes. Su gran ventaja, es que es rápido y es pertinente su utilización en el seguimiento de un proceso, ya sea cultivo en batch o continuo, pero no es capaz de diferenciar células vivas de muertas (su gran debilidad). Por eso, los métodos directos utilizados fueron el recuento de células y la Turbidimetria.

A través del recuento microscópico, se permite graficar el crecimiento microbiano de una población; ya sea la cantidad de células o el tamaño de la misma, y su curva presenta distintas fases, de las cuales se pueden identificar desde su latencia hasta su declinación, en cambio la Turbidimetria nos da a conocer gráficamente datos por medio de la absorbencia de energía (espectrofotometría).

Parte Experimental

• Materiales:

 15 tubos con caldo nutritivo

 1 Gradilla

 Pipetas estériles

 Propipetas

 Matraz Erlenmeyer con cando nutritivo y previamente inocoluda con E. coli

 Estufa para incubar.

 Microscopio.

 Porta objetos

 Cubre objetos

 Cámara de Neubauer.

 Espectrofotómetro

• Procedimientos:

 Tomar 15 tubos de ensayos y asignar 7 para la serie 1 y 7 para la serie 2, dejando uno sin inocular para ser usado como control.

 Inocular a partir del matraz la primera serie con 1 ml de medio con E. Coli; Repetir el procedimiento con la segunda serie, pero esta vez con 2 ml por tubo de ensayo.

 Colocar los tubos en la gradilla e introducirlos en la Estufa a 37°C

 Posteriormente realizar conteo de microorganismos en cámara de Neubauer; es conteo debe realizarse cada 30 min hasta terminar la serie completa.

 Registrar los valores de ambas series.

 Luego medir absorbancia en espectrofotómetro, de cada tubo de ambas series y registrarla; En este paso es necesario utilizar el tubo de control.

 Determinar el número de microorganismos por ml.

Desarrollo y Resultado

1. Densidad óptica:

La siguiente tabla muestra concentración de bacterias en unidades de Abs por tiempo en que se tomo la muestra.

Los datos fueron obtenidos en un espectrofotómetro de absorción molecular (Shimadzu UV-160).

Densidad óptica (Abs)

Tiempo (min) Serie 1 Serie 2

1 30 0,16 0,196

2 60 0,186 0,208

3 90 0,204 0,345

4 120 0,189 0,224

5 150 0,275 0,306

6 180 0,189 0,272

7 210 0,204 0,303

El siguiente grafico representa una curva de crecimiento bacteriano (E.coli).

Resultados:

A. Turbidimetria:

• Serie1.

1.- Tasa de crecimiento(u):

La ecuación que describe la recta es y = 0,0106x + 0,1644, por lo tanto, si la tasa de crecimiento es igual a la pendiente de la recta, seria el coeficiente de x, 0,0106.

Tasa de crecimiento (u)=0,0106 (1/horas)

2.- Tiempo de generación o duplicación (Tg):

- Tg=(Ln2/u), si se reemplaza el valor de u.

- Tg=(Ln2/0,0106)= 65,39hrs.

Tiempo de generación (Tg)=65,39 Horas.

• Serie 2.

1.- Tasa de crecimiento(u):

La ecuación que describe la recta es y = 0,0345x + 0,1715, por lo tanto, si la tasa de crecimiento es igual a la pendiente de la recta, seria el coeficiente de x, 0,0345.

Tasa de crecimiento (u)=0,0345 (1/horas)

2.- Tiempo de generación o duplicación (Tg):

- Tg=(Ln2/u), si se reemplaza el valor de u.

- Tg=(Ln2/0,0345)= 65,39hrs.

Tiempo de generación (Tg)=20,09 Horas.

Discusión

Respeto a los utensilios y/o materiales de laboratorio, se perdío una gran cantidad de tiempo, ya que no se contaba con la cantidad adecuada de instrumental, y por lo mismo, se debía esperar por lo menos 30 minutos por muestreo. Debido a esto, se cree que grandes márgenes de errores se dieron en algunos datos.

Para mejorar la linealidad de los gráficos, se eliminaron datos que permitió representar de mejor manera el crecimiento microbiano, los datos eliminados se consideraron como erróneos.

Teóricamente el grafico debería representar todas las fases de crecimiento microbiano (Lag, Log, estacionaria y muerte), pero debido a la falta de instrumental y las largas esperas para poder muestrear solo se pudo observar una fase exponencial con una pendiente no muy pronunciada, lo que no representaría el crecimiento típico de la bacteria E. Coli.

Conclusión

Aun que los resultados no representan lo encontrado en bibliografías, se pudo determinar valores para u y Tg, los cuales se presentan en la siguiente tabla.

Recuento en cámara Turbidimetria

Serie 1 Serie 2 serie 1 Serie 2

Tg 65,39 20,09

u 0,0106 0,0345

Los tiempos de generación son significativamente distintos por lo cual un promedio no sería una medida muy representativa de este coeficiente.

La curva obtenida no se considera representativa por lo tanto se sugiere repetir el trabajo. 

Bibliografía

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ecoliinfections.html

http://blog.ciencias-medicas.com/archives/1373

http://vidayestilo.terra.cl/salud/vida-sana/evite-el-contagio-de-escherichia-coli-con-10-pasos-sencillos,3528d57d2b6f7310VgnVCM20000099cceb0aRCRD.html

http://www.geosalud.com/enfermedades_infecciosas/ecoli.html

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