Práctica 9. “ELECTROFORESIS”

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Práctica 9. “ELECTROFORESIS”

Liliana Sarahí Acosta Hernández1, Ruth Carolina Fernández Vázquez2, José Eduardo Figueroa Reséndiz3. M. en C. Jessica Escobar Cabrera.

Resumen

El presente reporte se realizó con el propósito de conocer mejor el fundamento y realización de la técnica de separación de proteínas denominada electroforesis SDS-PAGE. Con el objetivo de obtener el conocimiento teórico y práctico de la técnica de electroforesis de proteínas, se realizó la preparación de geles de poliacrilamida  que son los utilizados en una SDS-PAGE, así como la preparación de las soluciones necesarias para un buen rendimiento en la electroforesis, y finalmente la realización de la electroforesis  para la separación de proteínas en una muestra

Palabras Clave: Electroforesis, Separación, Macromoléculas, Fundamento,

Marco Teórico

Al igual que cuando se tiene una mezcla de sustancias que se requieren analizar por separado y se necesitan metodologías para lograr dicha separación, es importante para procesos analíticos bioquímicos separar o “aislar” macromoléculas específicas para trabajar con ellas, y uno de los procedimientos más usados es la electroforesis.

La electroforesis, es un procedimiento en el cual una partícula cargada se hace desplazar en un medio aplicando un campo/corriente eléctrica. Por lo tanto, es útil para lograr que macromoléculas como péptidos, proteínas o ácido nucleicos se muevan hacia un polo, ya sea negativo o positivo, en función de la carga que posean y sean separados por la velocidad de su migración a través del medio por la influencia del campo eléctrico.

Conocimientos Previos

1.- Fundamento de la Electroforesis en Poliacrilamida PAGE

El principio básico de la electroforesis es que una molécula con carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. La técnica de electroforesis aprovecha esto para separar proteínas y otras macromoléculas como ADN y ARN.

En el caso de las proteínas, presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico, más concretamente, si el pH es bajo, los grupos ionizables están protonados, y la carga neta de la proteína es de signo positivo; y si el pH es alto, los grupos ionizables están desprotonados, y la carga neta es de signo negativo.

Actualmente una de las técnicas de electroforesis más utilizada es la SDS-PAGE, por su nombre en inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, esta técnica permite separar las proteínas de acuerdo a sus masas moleculares. Hace uso de SDS, dodecil sulfato sódico que es un detergente que rompe todos las interacciones no covalentes en las proteínas, básicamente las desnaturaliza, y forma un complejo que tiene una gran carga negativa. Posteriormente se somete al proceso eléctrico, las proteínas pequeñas se desplazan rápidamente a través del gel mientras que las grandes se quedan cerca del lugar de aplicación, siendo entonces el desplazamiento linealmente proporcional a logaritmo de su masa.

2.- Aplicaciones de la electroforesis PAGE

Se utiliza para medir el peso molecular de algunas biomoléculas, así como para estimar el tamaño de estas.

Se utiliza en Western Blot, el cual es un método utilizado para la detección de virus por medio de la identificación de proteínas que los componen; o para el análisis de modificaciones post traduccionales

Se utiliza para analizar el tamaño y número de subunidades polipeptídicas.

Objetivos

• Obtener el conocimiento teórico y práctico de la técnica de electroforesis de proteínas (SDS-PAGE).
• Realizar la preparación de geles para electroforesis.
• Realizar una cuantifica de proteínas por el método de Bradford para saber la cantidad a utilizar en la electroforesis.

Hipótesis

La electroforesis es un método para la separación de macromoléculas, por lo tanto, se espera observar las bandas características que corresponden a la separación de dichas macromoléculas.

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