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Reseña al artículo " Traducción independiente de la estructura 5´cap del ARN genómico del virus dengue"

El presente artículo de investigación describe la participación de metil-guanosín-trifosfato (5´cap) y de la región inicial del ARN genómico del virus dengue serotipo 2 (DENV-2) genotipo Americano en la traducción, mediante el uso de un sistema libre de células obtenido de placenta humana.

La existencia de un mecanismo alternativo de traducción en el DENV, independiente de la 5´cap, se piensa, esta relacionada con el hecho de que el DENV no inhibe la traducción celular, pudiéndose reproducir en condiciones celulares adversas, por tanto, es posible su uso como blanco terapéutico.

Sabiendo que el virus del dengue (DENV) es un Flavivirus de la familia Flaviviridae y es agente causal de la enfermedad del dengue. Mientras que por otro lado, el serotipo 2 (DENV-2) está relacionado con la infección más severa conocida como dengue hemorrágico.

El genoma del DENV consta de una cadena de ARN sentido positivo (ARN genómico) que actúa como ARNm y, subsecuentemente, como molde para la replicación del virus. La secuencia traducible (ORF) del ARN genómico del DENV codifica una poliproteína única que es procesada en tres proteínas estructurales (C, prM y E) y siete no estructurales, está flanqueada por las regiones no traducibles 5´UTR y 3´UTR, que contienen estructuras secundarias conservadas (SLA, SLB y SL, PK1 yPK2 respectivamente) implicadas en la regulación de la traducción, replicación, transcripción y patogénesis viral.

Se preparó un plásmido recombinante (pTZ18R-D2) conteniendo en el ADN de la cápside viral, utilizado para transcribir el ARN correspondiente (ARN-D2), sin la 5´cap. El ARN-D2 fue traducido en un sistema constituido por la fracción posmitocondrial (S-30) de placenta humana y se evaluó la incorporación de [14C] aminoácidos en presencia del ARN-D2 y en su ausencia (control), además, se analizó el efecto sobre la traducción de oligonucleótidos antisentido (OAs).

La transcripción se realizó utilizando el plásmido recombinante, donde se insertó la secuencia del ARN-D2.  Además, se corroboro la presencia de este plásmido mediante el análisis de restricción donde se demuestra que el pTZ18R-D2 contiene la secuencia del ADN-D2 adyacente al promotor para la T7 polimerasa y en la orientación indicada para que la transcripción rinda el ARN-D2 con los primeros 297 nt del DENV-2. La cantidad de ARN-D2 en la mezcla de transcripción se cuantificó indirectamente mediante un método colorimétrico adaptado para determinar el fosfato liberado (Pi) en la hidrólisis de nucleótidos en sistemas biológicos. Se analizó el transcrito obtenido (ARN-D2, sin la 5´cap) mediante electroforesis en gel de agarosa (2%) observando que el producto fue una banda única, con el tamaño esperado de 308 nt. Lo que mostró que se preservan las estructuras SLA, SLB y cHP, implicadas en la replicación y traducción del genoma del DENV.

La traducción del ARN-D2 se realizó en un sistema libre de células formado por la fracción posmitocondrial (S-30) de placenta humana. Observando que el ARN-D2 produjo un incremento significativo en la incorporación de aminoácidos, con estimulación del 75% de la actividad traduccional respecto al control. Estos resultados demostraron la traducción independiente de 5´cap del ARN-D2.

De acuerdo con el artículo en algunos ensayos, la mezcla de transcripción fue incubada previamente con cada uno los OAs. Los ensayos de traducción se procesaron para determinar la radiactividad (dpm) asociada a cada segmento por contaje de centelleo líquido. Para analizar el producto de la traducción, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (15%). La formación de híbridos (ARN-D2/OAs) se comprobó por el retardo en el patrón de migración electroforética del ARN-D2. Cuando se añadió el híbrido ARN-D2/OAs5 al ensayo de traducción, se observó una disminución significativa sobre la incorporación y ninguno de los OAs por sí solos afectaron la traducción del ARNm endógeno del sistema (control). Por tanto, el efecto inhibitorio del OAs5 fue específico para la traducción del ARN-D2.

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