Resistencia A Virus

Agrobiotecnología. Curso 2011

Resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética

Estrategias de protección antiviral en plantas

Transparencias 16-19

En la década de 1930 se observó que la inoculación previa de una planta con un virus la protegía contra la inoculación posterior con un virus relacionado. Este fenómeno se denominó “protección cruzada”. Utilizando este procedimiento se ha logrado protección de numerosos cultivos como tomate, tabaco, citrus, papaya, vid, cucurbitáceas etc. Los casos más conocidos se describen en la transparencia 17. Sin embargo, el uso de la protección cruzada tiene varias desventajas. Algunas de ellas se mencionan en la transparencia 18.

La transparencia 19 resume las estrategias de resistencia a virus que pueden implementarse utilizando ingeniería genética. Para una revisión general de las estrategias disponibles pueden consultarse las referencias que se enumeran al final de la clase. Las estrategias señaladas en color amarillo se desarrollarán en más detalle en esta clase.

Resistencia derivada del patógeno mediada por la expresión de proteínas virales

Transparencias 20-42

En 1985 Sanford y Johnston enunciaron por primera vez el concepto de resistencia derivada del patógeno y propusieron una estrategia general para obtener resistencia a un patógeno expresando funciones clave del mismo en proporción inadecuada o en forma disfuncional en la célula huésped. Debido a que se conocía bien su genoma y ciclo de vida, los autores utilizaron al bacteriófago Qb como modelo para ilustrar esta teoría. Este virus codifica tres proteínas: una proteína de cápside viral, una proteína que constituye una subunidad de la replicasa viral (el huésped provee las otras tres subunidades) y una proteína de maduración (involucrada en la unión a los pili y a la lisis posterior de la bacteria huésped). La proteína de la cápside tiene un rol regulatorio además de un rol estructural. En una etapa tardía del ciclo de multiplicación viral, ésta proteína se une al cistrón que codifica la replicasa viral, arrestando así la transcripción de éste gen y la multiplicación viral y permitiendo el ensamblaje de las partículas virales. Estos autores propusieron colocar el gen de la cápside viral bajo el control de un promotor constitutivo de Escherichia coli de manera que, al ingresar el bacteriófago a la célula, la abundancia de cápside viral provocara la represión de la replicasa y, con ello, la resistencia al virus. Por otro lado, la replicasa viral tiene afinidad por el ARN genómico viral y por las tres subunidades de la replicasa codificadas por el huésped. Como alternativa, los autores propusieron expresar en bacterias versiones mutadas de la polimerasa viral que posean una afinidad normal por el genoma viral, pero que sean incapaces de unirse a las subunidades del huésped, lo que inhibiría así la replicación viral.

La transparencia 22 muestra el ciclo replicativo generalizado de un virus a ARN. En esta y otras transparencias posteriores, se señalan en un color distinto las etapas que pueden ser alteradas por ingeniería genética con el propósito de desarrollar resistencia. Todos los pasos señalados resultan críticos para el normal desarrollo del ciclo viral y un bloqueo en cualquiera de estos niveles promovería la pérdida de virulencia total o parcialmente. Uno de estos pasos críticos es la decapsidación del virión, proceso que ocurre inmediatamente después que este ingresa en el citoplasma de la célula vegetal.

El primer antecedente de resistencia a virus de plantas introducida por ingeniería genética se debe a los experimentos realizados por el laboratorio de Roger Beachy en 1986. Tratando de confirmar los postulados de Sanford y Johnston, este grupo expresó en forma constitutiva el gen de la proteína de la cápside del Tobacco mosaic virus (TMV) en plantas de tabaco. La transparencia 23 muestra ensayos tomados del trabajo que describió por primera vez la resistencia mediada por esta estrategia (“resistencia mediada por la proteína de la cápside”; CPMR). En el panel A, se muestra el porcentaje de plantas de tabaco (cultivar Xanthi) que mostraban síntomas a distintos días luego de la inoculación con TMV en tres líneas transgénicas (llamadas 3646, 3773 y 3404; representadas en los tres paneles inferiores) que expresan (barras verdes) o no expresan (barras violetas) el gen de cápside del mismo virus. El número entre paréntesis indica el número de plantas de cada tipo que fueron evaluadas. Como control (panel superior) se analizó la evolución de los síntomas en plantas de tabaco no transgénicas de dos cultivares, Xanthi (barra verde) y Samsun (barra celeste). Mediante estos ensayos, se concluyó que las plantas que expresan el gen de la proteína de cápside del TMV muestran un retraso en la aparición de los síntomas debidos al virus. En el panel B, se midió el porcentaje de plantas de tabaco que mostraban síntomas, a distintos días de la inoculación con concentraciones variables de inóculo viral (2 μg/ml, 0,8 μg/ml y 0,4 μg/ml), en plantas que expresan (barras verdes) o no expresan (barras violetas) el gen de cápside del mismo virus. El número entre paréntesis indica el número de plantas de cada tipo. Mediante este ensayo se concluyó que la eficacia del mecanismo de resistencia es inversamente proporcional al nivel de inóculo viral. En general, las plantas protegidas mediante estos abordajes, muestran un retardo temporal del desarrollo de síntomas, una atenuación en la sintomatología característica de cada virus, una menor cantidad de sitios de infección y un menor título viral. Se demostró asimismo que hay una correlación entre la resistencia y el nivel de expresión de la proteína de la cápside, que la protección actúa a nivel celular y es superada por altas dosis de inóculo (viriones).

La transparencia 24 muestra resultados de un trabajo realizado para intentar determinar el mecanismo que origina la CPMR a nivel molecular. Los paneles A y C muestran la acumulación de proteína de cápside de TMV en pg por célula en protoplastos infectados con TMV (panel A) o con ARN de TMV (panel C). Los protoplastos obtenidos a partir de plantas que expresan el gen de cápside del TMV (CP+) se muestran en anaranjado y los protoplastos que no la expresan (CP-) se muestran en azul. Los paneles B y D muestran la acumulación de ARN de TMV en pg por cada 5.000 protoplastos de tabaco infectados con TMV (B) o con ARN de TMV (D) en protoplastos obtenidos a

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