Resumen Control 4 Microbiologia

Control 4 – “Recuento Bacteriano y Análisis de Agua”

CRECIMIENTO BACTERIANO

• Crecimiento: Incremento ordenado de componentes de un organismo. Multiplicación celular es consecuencia del crecimiento.
• Se mide en concentración celular (número de células por volumen) o densidad celular (peso seco por volumen).
• Sea dB/dt = a*B con B masa bacteriana y a la tasa constante de crecimiento instantáneo.
  Por lo tanto: ln(Bt) = ln(B0) + a*t
• tD: Tiempo medio de generación → 1/tD = u = 1,45*a
• u: Tasa constante de crecimiento exponencial [generaciones/h]

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

• Procedimiento para conocer el número de microorganismos en una muestra.
• Recuento de totales: Microorganismos vivos y muertos. Viables: Solo vivos.
• Recuento directo: Microscopio. Indirecto: Por crecimiento o propiedad.
• Recuento de totales:

• Recuento de Breed:

• Usado para recuento de MO en la leche.
• Sobre portaobjeto, se dibuja un cuadrado. Homogenizar muestra y con pipeta Pasteur colocar una gota de muestra sobre el cuadrado y extenderla. Secar y fijar al calor.
• Cubrir con cristal violeta por 1 minuto. Lavar y secar.
• Observar al microscopio con aceite de inmersión.
• N° Células/mL = X de célula por campo*3000*100.
• 3000: Área del campo del microscopio. 100: Inverso del inoculo.

• Recuento con cámara de Petroff-Hauser o Hermocitómetro:

• Colocar gota de cultivo en un portaobjetos Hemocitómetro (originalmente ideado para glóbulos rojos).
• Excavación posee 25 cuadrados y cada uno 16 cuadrados más pequeños.
• Contar células presentes en varios cuadrados grandes y sacar promedio. Multiplicarlo por 25 (para mm2). Multiplicarlo por 50 (para mm3). Multiplicarlo por 1000 (para cm3).
• N° Células/mL = X*25*5’*1000.

• Recuento con sales de tetrasolium:

• Dichas sales se agregan, se reduce por metabolismo y se tiñe rojo. Células muertas quedan sin teñir.

• Recuento por microscopia de fluorescencia:

• Bacterias se tiñen con naranja de acridina, capaz de integrarse al ADN (quedan células fluorescentes). Directo y viable/totales.

• Recuento de células viables:

• Método de la placa extendida:

• Muestra de 0,1 [mL] se extiende asépticamente.
• Incubación hasta que colonias sean visibles.
• Numero de colonias → Número de células.

• Método de placa vertida:

• Muestra mezclada con agar a 45-50 [°C], colocándose sobre una placa Petri estéril.
• Formación de colonias, por lo que es sensible. Recuento de lodos o suspensiones en alimentos.
• Desventaja: MO dañados por breve calentamiento.
• Permite identificación positiva. Cada colonia se origina de una celula. Si es mezcla, no se pueden diferencias entre colonias.
• Debe haber al menos 300 colonias por placa.

• Método de las diluciones y plaqueo:

• Se toma 0,1 [mL] y se diluye en 9 [mL] de solución salina al 0,8% de cloruro de sodio. Así sucesivamente hasta llegar a dilución 10^-10.
• Cada dilución con una pipeta nueva.
• De las últimas tres se toma 0,1 [mL] y se siembra en superficie en placa Petri con agar nutritivo. Con asa Drigalsky se homogeniza.
• Incubar placa a temperatura adecuada por 24 – 48 horas.
• Contar número de colonias. Solo tomar en cuenta las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Sacar promedio.
• N° Células/mL = X colonias*1/Dilución*1/Inoculo.

• Método turbidímetro:

• A medida que crece población celular, el medio presenta turbidez.
• Se mide por un espectrofotómetro.
• En un tubo especial se coloca medio de cultivo. Se interpone entre un foco luminoso y una unidad fotoeléctrica, acoplada con galvanómetro o disco de lectura, registrando el porcentaje de luz transmitida.
• Porcentaje de luz se relaciona inversamente con la turbidez.
• Rápido y sencillo. Confección de curvas de crecimiento.

• Número más probable de microorganismos:

• Se diluye hasta que densidad celular sea menor a 1 célula por mL.
• Se toma cantidad pequeña de muestra por duplicado y cada una es inoculada en un tubo, donde posteriormente se incuba. Usado para trabajar con series de 3, 5 o 10 tubos por cada dilución. Mayor cantidad de tubos indica mayor precisión.
• Utilización de tablas de probabilidades.
• Ver que tubos presentan turbidez y se asignan números.
• Para MO difíciles de cultivar en medios sólidos. También se utilizan en medios líquidos.

• Recuento de filtro de membrana:

• Para determinación de coliformes. Algunas muestras difíciles de analizar por turbiedad del medio.
• Pasar con ayuda de vacío la muestra de agua a través de una membrana celulosa de 0,45 micrones. En aguas contaminadas se debe diluir previamente la muestra.
• Número ideal de colonias en el filtro entre 20 y 60.
• Filtro colocado en placa Petri con un medio agar adecuado:

• M-FC para coliformes fecales a 45 [°C] por 24 horas.
• M-Endo para coliformes totales a 37 [°C] por 24 horas.

• Tiempo de filtración hasta incubación sin exceder los 30 minutos.
• Ventajas: Resultados rápidos, volúmenes mayores de muestra, resultados más precisos y equipos no ocupan un mayor espacio.
• Limitaciones: En muestras con gran cantidad de sólidos, el crecimiento se constituye en una película, imposibilitando el recuento.

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