VIH-1

Antecedentes

La fase asintomática de la infección VIH-1 se caracterizó por el progresivo agotamiento de las efectoras periféricos / memoria (CD45RO +) células T CD4 + células T no infectados que conduce a la inmunodeficiencia posterior y los síntomas del SIDA. Una de las posibles consecuencias de esta disfunción consiste en el mecanismo de la activación inducida la muerte celular (AICD) que se implica en mejorar y acelerar en no infectados CD45RO + / CD4 + células T por la presencia del virus. La interacción del VIH viral sobre la glicoproteína gp120, con CD4 de la superficie de la célula huésped induce cambios conformacionales en la gp120 que permite al dominio V3 de la gp120 interactuar con el anfitrión receptores de células quimiocinas, CCR5 o CXCR4. A pesar de la importancia funcional de la V3 en la infección por VIH ha sido bien establecida, los efectos de la V3 en la cascada de señalización de la célula huésped correceptor se han mantenido a lo largo de la última década. En CCR5-trópico de VIH aislado (cepas R5), la participación del gp120 dominio V3 (V3 loop) en la interacción con el receptor CCR5 es crucial para la entrada y enlace de células. Las cepas R5 predominan en la fase asintomática, mientras que los aislamientos que utilizan el CCR5 y CXCR4 (R5X4 cepas) o sólo CXCR4 aparecen mucho más tarde en el 40-50% de los individuos infectados y esto a menudo indica el comienzo de la fase clínica. La persistencia de una exclusiva población viral in vivo de R5 no es rara y es suficiente para causar inmunodeficiencia en la mayoría de los individuos infectados de VIH-1 que desarrollan SIDA.

Hemos demostrado anteriormente que la presentación de antígenos puede ser desregulada por la presencia de epítopos V3 en la superficie de los macrófagos. CCR5 es uno de los principales mediadores de la señalización intracelular V3-inducida durante la presentación de antígenos lo que lleva a la AIDC, la interacción V3-CCR5 por sí misma es de naturaleza iónica. Los estudios de chips de ADN (microarrays) utilizando en su totalidad gp120 han

mostrado un aumento de la expresión de los genes pertenecientes a las vías transducción de señales de la activación de mitógenos de la proteína quinasa de la proteína quinasa y genes que regulan el ciclo celular en PBMCs.

En vista de la posible participación de V3 en el proceso anormal AICD de las CD4 + T células infectadas, en este estudio abordamos los efectos de la V3 en la señalización intracelular de células CD4 + T. Investigamos las diferencias transcripcionales en las células humanas primarias CD4 + T atribuidas a la presencia V3 durante la señalización de la presentación de antígenos. Expusimos macrófagos a lipopéptidos sintéticos lineales de la corona de la V3 presentada en liposomas y luego inducimos la fomación de conjuntos de presentaciones de antígenos con células CD4 + T a través de un sistema de presentación superantígeno. Implementando el análisis de oligonucleótidos de ARNm microarrays en células CD4 + T, evaluamos el impacto de la corona del V3 en el estado transcripcional de la respuesta de las células CD4 + T.

Clasificación funcional de los genes significativamente modulada y la identificación de las vías canónicas y análisis de redes de genes funcionales se llevaron a cabo por una IPA (Ingenuity Pathways Analysis) plataforma y sobre-representación de ontologías funcionales por Recursos de Bioinformática DAVID.

Métodos

Péptidos y liposomas

El VIH-1 gp120/V3 péptido RKSIRIQRGPGRAFY (LAI tensión, aa 304-318) fue sintetizado utilizando química F-moc /tBu. Lipopéptidos fueron producidos por unión covalente de serina-S-[2,3-bis (palmitoyloxy)- (2RS)-propil]-N-palmitoil-(R) cisteína (Boehringer Mannheim Biochemica, Alemania) al péptido V3, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Liposomas fueron construidas por el método de deshidratación-rehidratación y se reconstituyó con 100 µl de agua destilada. El material no atrapado fue removido lavándolo con PBS.

Celda de aislamiento

Abrigos buffy de salud, donadores de sangre de HIV-1/Hepatitis b sero-negativas se obtuvieron del Hospital Venizelio del Servicio de Transfusión de Sangre, Heraklion, Creta.

Se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes voluntarios. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron aisladas por centrifugación de gradiente de densidad con ficoll-paque (Amersham-Pharmacia, Uppsala, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cultivadas en medio RPMI-1640 complementado con antibióticos y 5% de suero humano. El agotamiento de las células CD8 + se llevó a cabo con el sistema clasificación de células magnéticas (MACS) (Miltenyi Biotech, Alemania), utilizando PE anti-humano CD8 (Mouse IgG1, k, RPA-T8, BD Pharmingen) y anti-PE microbeads (Mouse IgG1, Miltenyi Biotech, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la finalización del experimento de cultivo celular, las células recolectadas para el análisis de microarrays consiste de 86% CD3 + CD4 + y 11% CD3 + CD8 + doble positivos. Esta población celular se refiere como "CD4 enriquecido".

De cultivo celular y análisis de microarrays de oligonucleótidos

Los cultivos primarios de células se cultivaron por triplicado durante 3 día, ya sea con liposomas normales (control) o liposomas con péptidos lipoV3 incorporado en la superficie del liposoma. 8 horas después de la adición de 1 ng / ml de enterotoxina estafilococo A (Sigma-Aldrich Chemical Co.), la extracción total de RNA se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante utilizando columnas centrífugas de base de sílica (Qiagen RNeasy kit, Hilden, Alemania). La concentración de ARN se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm. La pureza se estimado por la relación de absorbancia 260/280 nm y la integridad se evaluó mediante electroforesis de gel de agarosa. El ARN de alta calidad se obtiene a partir de tres células de cultivos tratadas de forma independiente del mismo donador. Las muestras de RNA fueron sometidas a oligonucleotidos microarrays de Aros de Biotecnología Aplicada (Dinamarca) usando el Genoma Humano U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Estos chips contienen 54000 sondas fijas que podrían reconocer las transcripciones de 38.500 genes humanos. Las muestras V3 y ARN control fueron hibridadas en tres chips de microarrays por separado

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